四環(huán)素誘導(dǎo)豬MC4R基因表達(dá)載體的構(gòu)建及體外表達(dá)研究.pdf

1、黑素皮質(zhì)素受體-4(Melanocortin-4 receptor，MC4R)是下丘腦腹內(nèi)側(cè)核分泌的一類肽類物質(zhì)，跨膜G蛋白耦聯(lián)受體家族成員之一。豬MC4R基因被認(rèn)為是影響豬生長(zhǎng)肥育的主效基因之一，是參與調(diào)控體重、采食和能量平衡的關(guān)鍵信號(hào)物質(zhì)，因此研究MC4R基因的功能及代謝通路具有重要意義。然而在研究真核基因功能的過程中，外源基因的持續(xù)表達(dá)，會(huì)對(duì)基因功能的研究有很大的局限性。四環(huán)素誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)的出現(xiàn)克服這個(gè)缺點(diǎn)，它已經(jīng)成為應(yīng)用最廣泛的

2、誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)，能在時(shí)間上調(diào)控基因的表達(dá)，使基因功能的研究更為細(xì)致。
　　 本實(shí)驗(yàn)采用四環(huán)素誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)(Tet-On)，其由轉(zhuǎn)錄元件pTet-On載體，反應(yīng)元件pTRE載體和誘導(dǎo)劑構(gòu)成。利用分子生物學(xué)技術(shù)，克隆豬的MC4R基因完整編碼區(qū)，把豬MC4R基因插入到pTRE載體下游的MCS位點(diǎn)上，從而構(gòu)建pTRE-MC4R(P1)載體;克隆轉(zhuǎn)錄元件pTet-On載體和反應(yīng)元件pTRE載體的主要片段，將豬的MC4R基因插入到克隆的反應(yīng)元

3、件的MCS位點(diǎn)上，采用雙酶切和連接等方法將上述元件連接到pcDNA3.1(+)，構(gòu)建重組質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-rtTA-PTight-MC4R(P2)誘導(dǎo)載體。將重組質(zhì)粒P1和P2分別轉(zhuǎn)染到豬成纖維細(xì)胞中，用誘導(dǎo)劑強(qiáng)力霉素(DOX)在5μg/mL濃度下誘導(dǎo)載體通路的開啟，檢測(cè)該通路中MC4R基因的表達(dá)，同時(shí)檢測(cè)誘導(dǎo)前后與MC4R相關(guān)基因（MC3R，AGRP，NPY, POMC,Leptin）的表達(dá)量變化。為了進(jìn)一步研究MC4R基因

4、的生物學(xué)功能及制備高成活率轉(zhuǎn)基因豬做準(zhǔn)備。研究結(jié)果如下:
　　 (1)成功克隆豬的MC4R基因完整編碼區(qū)序列，大小為999 bp。
　　 (2)成功構(gòu)建了表達(dá)豬MC4R基因的兩個(gè)誘導(dǎo)表達(dá)載體P1和P2。
　　 (3)將載體P1和編碼四環(huán)素阻遏蛋白的pTet-On載體共轉(zhuǎn)染豬成纖維細(xì)胞，加入Dox后，MC4R基因表達(dá)量極顯著升高（P＜0.01）。
　　 (4)將融合載體P2轉(zhuǎn)染豬成纖維細(xì)胞，加入Dox后，同