惡性瘧原蟲四環(huán)素誘導(dǎo)性轉(zhuǎn)基因表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建與檢測.pdf

1、該文擬建立一種抑制型瘧疾四環(huán)素可誘導(dǎo)轉(zhuǎn)基因表達(dá)系統(tǒng),為研究可能在瘧疾預(yù)防與治療中有重要作用的新基因打下基礎(chǔ).但是目前已有的誘導(dǎo)性啟動子在瘧原蟲中不具有功能性,而瘧原蟲本身又沒有誘導(dǎo)性啟動子.為構(gòu)建一個在瘧原蟲對四環(huán)素或其類似物具有可誘導(dǎo)性反應(yīng)的重組啟動子,將7個拷貝的TetO(7-Copy ofTetO,7cot)插入到GBP130啟動子單個轉(zhuǎn)錄起始位點(Transcriptional Initiation Site,TIS)附近.但由

2、于在該TIS位點附近沒有合適的限制性位點可用,首先利用重疊延伸PCR的方法在TIS上下游不同位點(即-5,-2,+2和+5)分別引入一個BamHI位點.以pTL-8為模板PCR擴增出7cot,然后利用其兩端的BglⅡ與BamHI連接,分別構(gòu)建4個反應(yīng)載體,即pG/7T(-5),pG/7T(-2),pG/7T(+2)和pG/7T(+5).經(jīng)PCR、限制性酶切和DNA測序分析表明構(gòu)建完全正確.為鑒定7cot插入GBP130啟動子后對啟動子活

3、性的影響,上述4個反應(yīng)載體及其原始載體pGBPCAT△2分別用來電轉(zhuǎn)環(huán)狀體惡性瘧原蟲.CATELISA檢測表明,4個反應(yīng)載體中的CAT表達(dá)水平均高于pGBPCAT△2,并且7cot的定位越靠近下游CAT表達(dá)水平越高.說明7cot插入GBP130啟動子后對啟動子活性有促進作用,當(dāng)7cot插入+5時啟動子活性最高.因此,載體pG/7T(+5)可用于瘧疾四環(huán)素可誘導(dǎo)轉(zhuǎn)基因表達(dá)系統(tǒng)中的反應(yīng)載體.為構(gòu)建調(diào)節(jié)載體,PCR擴增TetR后克隆入質(zhì)粒pD

4、的單克隆位點BamHI,其表達(dá)由伯氏瘧原蟲的二氫葉酸還原酶-胸苷合成酶基因的5'和3'側(cè)翼序列控制,構(gòu)成載體pDT.反應(yīng)載體和調(diào)節(jié)載體建成后,將pG/7T(+5)和pDT共轉(zhuǎn)染瘧原蟲,以脫羥基四環(huán)素(Anhydrotetracycline,ATc)進行誘導(dǎo),鑒定系統(tǒng)的誘導(dǎo)性.CAT檢測表明,在ATc加入和不加入的轉(zhuǎn)染組沒有明顯變化,即沒有可調(diào)控性變化.為進一步提高報告基因的敏感性,以LUC置換pG/7T(+5)中的CAT,構(gòu)成pGL(+