siRNA表達(dá)載體的構(gòu)建及其對(duì)MCF-7細(xì)胞hTERT基因表達(dá)抑制的研究.pdf

1、目的：構(gòu)建人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)基因的RNA干擾(RNAi)表達(dá)載體，并探討該表達(dá)載體對(duì)人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7細(xì)胞中hTERTmRNA表達(dá)的特異性抑制作用，為蛋白水平及細(xì)胞水平的進(jìn)一步研究奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。研究不僅為針對(duì)hTERT基因的RNA干擾提供新的有效的作用靶位，而且為體內(nèi)表達(dá)載體介導(dǎo)的RNA干擾作為一種有效的基因沉默技術(shù)的應(yīng)用提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為針對(duì)端粒酶的乳腺癌基因治療提供新的途徑，同時(shí)也對(duì)RNAi在腫瘤研究和基因治療方

2、面應(yīng)用的可能性進(jìn)行有益的探索。 方法：設(shè)計(jì)針對(duì)hTERT基因的干擾靶序列TGTFCAGCGTGCTCAACTA，合成具有該靶序列短發(fā)夾結(jié)構(gòu)的兩條寡核苷酸，其排列順序?yàn)锽amHⅠ酶切位點(diǎn)、19nt正義序列、9ntloop序列、19nt反義序列、RNA聚合酶Ⅲ終止子(6個(gè)T)、SalI酶切位點(diǎn)、HindⅢ酶切位點(diǎn)。合成后經(jīng)退火形成雙鏈DNA。將pGenesil-1表達(dá)載體經(jīng)BamHI、HindⅢ雙酶切后電泳分離，純化回收4800bp

3、左右的大片段。將退火形成的雙鏈DNA通過T4DNA連接酶連接到線性化pGenesil-1質(zhì)粒U6啟動(dòng)子下游，構(gòu)建重組siRNA表達(dá)質(zhì)粒pGenesil-hTERT。再將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化用CaCl2法制備的感受態(tài)細(xì)胞DH5a，經(jīng)Kanar抗性篩選，挑選陽性克隆菌落進(jìn)行搖菌擴(kuò)增，并抽提純化質(zhì)粒，然后將抽提的重組質(zhì)粒分別做PstI和SalI單酶切和瓊脂糖電泳分析，同時(shí)做測序鑒定以確定插入的干擾片段準(zhǔn)確無誤，即針對(duì)hTERT基因的siRNA表達(dá)載體

4、構(gòu)建成功。同時(shí)完成不針對(duì)任何基因的陰性對(duì)照重組質(zhì)粒的構(gòu)建。培養(yǎng)MCF-7細(xì)胞，待細(xì)胞生長狀態(tài)良好并達(dá)到指數(shù)生長期時(shí)，于轉(zhuǎn)染前一日接種于6孔板中，并設(shè)置空白組、脂質(zhì)體組、陰性對(duì)照組及pGenesil-hTERT組。以每孔脂質(zhì)體7.5μl、重組質(zhì)粒3μg配成轉(zhuǎn)染復(fù)合物，加入各孔MCF-7細(xì)胞中進(jìn)行轉(zhuǎn)染(脂質(zhì)體組用無菌水代替質(zhì)粒，空白組不加任何試劑)，轉(zhuǎn)染后48h重組質(zhì)粒上帶有的EGFP基因得以表達(dá)，熒光顯微鏡下觀察綠色熒光細(xì)胞所占比例，以此

5、來判斷轉(zhuǎn)染效率。接著用TRIzol試劑分別提取各組細(xì)胞總RNA，并應(yīng)用紫外分光光度計(jì)及瓊脂糖凝膠電泳檢測所提取RNA樣本的濃度、純度以及完整性。以各組總RNA為模板，β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)為內(nèi)對(duì)照進(jìn)行兩步法逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)，瓊脂糖凝膠電泳分析，并用灰度半定量檢測各組hTERTmRNA的相對(duì)表達(dá)量。統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用多樣本均數(shù)兩兩比較的方差分析。 結(jié)果：①pGenesil-1質(zhì)粒經(jīng)BamHI+HindⅢ雙酶切

6、后電泳可見4800bp左右的線性化質(zhì)粒條帶。②對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行PstI和SalI單酶切鑒定，酶切產(chǎn)物經(jīng)電泳分析顯示：重組質(zhì)粒因其PstI酶切位點(diǎn)被插入的目的基因片段取代，故無法被PstI酶切，但由于在插入的目的基因片段里設(shè)計(jì)了一個(gè)SalI酶切位點(diǎn)，因此被SalI酶切后可見一條約400bp的DNA條帶。同時(shí)測序鑒定也證實(shí)目的序列已準(zhǔn)確插入到預(yù)計(jì)位點(diǎn)，重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。③轉(zhuǎn)染后48h熒光顯微鏡下觀察，根據(jù)發(fā)綠色熒光的MCF-7細(xì)胞所占比率判斷

7、LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染MCF-7細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率達(dá)80％以上。④轉(zhuǎn)染48h后各組總RNA提取樣品經(jīng)紫外分光光度計(jì)測定，濃度為0.7～3.0μg/μl，純度OD260/OD280為1.7～1.9，符合逆轉(zhuǎn)錄要求。經(jīng)2％瓊脂糖凝膠電泳顯示28S、18S和5SrRNA三條帶，其中前兩者更清晰，且28S的亮度是18S的2倍左右，表明提取總RNA樣品可用作RT-PCR擴(kuò)增模板。⑤RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳分析顯示：各組泳道中內(nèi)

8、對(duì)照β-actin擴(kuò)增產(chǎn)物條帶(546bp)的亮度相似，而hTERT擴(kuò)增產(chǎn)物條帶(111bp)的亮度pGenesil-hTERT組明顯弱于其它三組?；叶葤呙璋攵拷Y(jié)果顯示，pGenesil-hTERT組、陰性對(duì)照組、脂質(zhì)體組和空白組MCF-7細(xì)胞中hTERTmRNA的相對(duì)表達(dá)量分別為0.188±0.020、0.737±0.009、0.733±0.015、0.753±0.014。經(jīng)q檢驗(yàn)方差分析，pGenesil-hTERT組hTERTm

9、RNA相對(duì)表達(dá)量分別與空白組、脂質(zhì)體組及陰性對(duì)照組相比，均下降75％左右，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，而其它三組之間相比，無顯著性差異(P＞0.05)。 結(jié)論：①設(shè)計(jì)合成的shRNA干擾序列準(zhǔn)確無誤地克隆到pGenesil-1表達(dá)載體中，針對(duì)hTERT基因的siRNA表達(dá)載體構(gòu)建成功。該載體的構(gòu)建可為深入研究端粒、端粒酶在腫瘤細(xì)胞中的作用提供新的手段。②應(yīng)用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑能高效地將重組載體轉(zhuǎn)染入MCF-7細(xì)胞，從而保證了重

10、組載體在細(xì)胞內(nèi)高效地表達(dá)。③針對(duì)hTERT基因的RNAi靶序列設(shè)計(jì)有效，針對(duì)該靶序列構(gòu)建的RNAi體內(nèi)表達(dá)載體在mRNA水平有效并特異性地抑制了MCF-7細(xì)胞中hTERT的表達(dá)，與反義核酸技術(shù)相比，抑制效果明顯提高，因此運(yùn)用體內(nèi)表達(dá)載體介導(dǎo)的RNA干擾技術(shù)抑制腫瘤相關(guān)基因的表達(dá)是高效可行的方法。④由于hTERTmRNA的表達(dá)與端粒酶活性相關(guān)，實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的siRNA體內(nèi)表達(dá)載體在顯著抑制hTERTmRNA表達(dá)的同時(shí)必然下調(diào)端粒酶活性，從而抑