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1、背景和目的:隨著人類基因組計(jì)劃的完成,現(xiàn)代基因治療學(xué)快速發(fā)展。利用RNA干擾(RNAi,RNAinterference)原理的knockdown技術(shù)在人類基因功能研究方面有著高效、特異、安全、穩(wěn)定等優(yōu)勢(shì)。RNAi已成為近年來(lái)基礎(chǔ)研究的熱點(diǎn),并在諸多惡性腫瘤研究中取得進(jìn)展。 端粒酶在85%以上的惡性腫瘤細(xì)胞中陽(yáng)性表達(dá),而在正常體細(xì)胞一般為陰性。隨著對(duì)惡性腫瘤發(fā)病機(jī)制研究的深入,發(fā)現(xiàn)端粒酶的激活是惡性腫瘤發(fā)生的先決條件。把端粒酶作為
2、腫瘤治療的靶點(diǎn)具有良好的應(yīng)用前景。目前研究認(rèn)為端粒酶復(fù)合體主要由人端粒酶RNA(hTR,humantelomeraseRNA)和人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT,humantelomerasereversetranscriptase)組成,其余的蛋白和它們相連,并促進(jìn)折疊和裝配。端粒DNA的合成必須以hTR為模板,通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄合成。最近研究報(bào)道hTERT既是影響端粒酶活性的最重要部分,也是端粒酶活性的限速組分,它在80-90%的腫瘤細(xì)胞中表達(dá)
3、,因此,靶向hTERT顯然更為理想。 本實(shí)驗(yàn)作為課題組的前期摸索實(shí)驗(yàn),旨在驗(yàn)證利用RNAi技術(shù),針對(duì)端粒酶的hTERTmRNA干擾舌癌細(xì)胞的hTERT表達(dá)是否有效,以期從中選擇最有效的小干擾RNA(siRNA,smallinterferenceRNA)為下一步的深入研究作準(zhǔn)備,以便探討siRNA表達(dá)載體作為舌癌基因治療新策略的可行性。 方法:1、根據(jù)Genbank提供的基因序列,按照Tuschl設(shè)計(jì)原則,利用計(jì)算機(jī)輔助設(shè)
4、計(jì)軟件,針對(duì)hTERTmRNA設(shè)計(jì)三組理論可能有效siRNA,利用基因克隆技術(shù)將其載入質(zhì)粒載體pGPU6,得到三組重組質(zhì)粒P1718、P1813、P3057,通過(guò)雙酶切鑒定和DNA測(cè)序鑒定;同時(shí)設(shè)立一非特異性對(duì)照組Pcontrol。 2、采用陽(yáng)離子脂質(zhì)體LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染法,分別將四組重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Tca8113細(xì)胞,同時(shí)設(shè)立空白對(duì)照,48h后采用RT-PCR對(duì)轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞內(nèi)hTERTmRNA表
5、達(dá)情況作半定量分析,Westernblot定性分析細(xì)胞內(nèi)hTERT蛋白的表達(dá)變化情況。 結(jié)果:1、經(jīng)雙酶切鑒定和DNA測(cè)序鑒定,證實(shí)成功構(gòu)建了三組siRNA質(zhì)粒載體P1718,P1813,P3057,和一組非特異性的重組質(zhì)粒Pcontrol。 2、四組siRNA重組質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)染細(xì)胞48h后,P1718,P3057,Pcontrol組的細(xì)胞mRNA表達(dá)均無(wú)明顯變化,而P1813組的mRNA表達(dá)下調(diào)明顯,平均抑制率為52%;
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