PTEN、Akt和Trx真核表達(dá)載體的構(gòu)建與Trx的表達(dá)檢測(cè).pdf

1、本文對(duì)PTEN、Akt和Trx的結(jié)構(gòu)功能以及在胰島素分泌中的關(guān)系進(jìn)行了闡述，構(gòu)建了PTEN、Akt和Trx基因的相關(guān)質(zhì)粒，檢測(cè)了Trx在細(xì)胞中mRNA水平的表達(dá)。這為研究ROS刺激下的胰島素分泌的分子機(jī)制提供了實(shí)驗(yàn)材料和檢測(cè)方法。主要研究?jī)?nèi)容如下：
　　 ⑴用RT-PCR法，從大鼠肝組織中提取總mRNA、合成cDNA并擴(kuò)增Trx基因，定向克隆到表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.0中，構(gòu)建pcDNA3.0-Trx重組質(zhì)粒，然后用PCR、酶切、

2、電泳和DNA測(cè)序鑒定，
　　 ⑵六孔板中，脂質(zhì)體介導(dǎo)pcDNA3.0-Trx和pcDNA3.0轉(zhuǎn)染NIH 3T3成纖維細(xì)胞各兩孔，再用終濃度50 μΜ H2O2刺激未轉(zhuǎn)染任何質(zhì)粒、轉(zhuǎn)染過(guò)pcDNA3.0和pcDNA3.0-Trx的各一孔，剩余一孔未轉(zhuǎn)染也未刺激的作為對(duì)照。用RT-PCR法，從上述NIH 3T3成纖維細(xì)胞中提取總mRNA并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以較純的一樣品依次倍比稀釋10-1-10-5作為標(biāo)準(zhǔn)品，建立檢測(cè)18s mR

3、NA的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
　　 ⑶實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上測(cè)出以上六種狀態(tài) Trx和18s的CT值，用2-△△ CT法分析Trx基因mRNA水平表達(dá)情況，測(cè)得終濃度50 μΜ H2O2刺激的細(xì)胞中Trx基因mRNA表達(dá)水平上確有提高。
　　 ⑷以pTRE-WT-PTEN、pTRE-G129R-PTEN、pTRE-G129E-PTEN質(zhì)粒中相應(yīng)PTEN為模板，用PCR技術(shù)得到野生型PTEN、G129R突變型PTEN、G129E突變型