白念珠菌磷酶酶B的原核表達(dá)、純化及功能驗(yàn)證.pdf

1、背景：白念珠菌是一種重要的人類致病真菌,可引起機(jī)體淺部和深部的廣泛損害,毒力因子包括黏附素、利于侵入的酶、形態(tài)發(fā)生及表型轉(zhuǎn)換、受體等幾個方面。其中磷脂酶B是白念珠菌重要的毒力因子,與白念珠菌致病有直接關(guān)系即在白念珠菌入侵宿主的早期發(fā)揮作用,包括對上皮細(xì)胞的黏附、入侵和損傷。磷脂酶B與白念珠菌感染密切相關(guān),其在感染過程中的作用逐漸受到重視,并逐漸成為研究熱點(diǎn)。
　　 目的：構(gòu)建磷脂酶B1和B2的重組表達(dá)體,在大腸桿菌中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)

2、,純化表達(dá)產(chǎn)物并進(jìn)行生物活性檢測,為探索磷脂酶B1和B2重組蛋白的致病和耐藥機(jī)制奠定基礎(chǔ),也為研制新型抗真菌藥物、診斷試劑及抗真菌疫苗等提供理論基礎(chǔ)及科學(xué)依據(jù)。
　　 方法：從白念珠菌中提取基因組DNA為模板,用PCR方法獲取磷脂酶B1和B2基因。將原核表達(dá)載體pEGX-4T-1分別與磷脂酶B1和B2基因行雙酶切,瓊脂糖凝膠純化,連接酶切產(chǎn)物,轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10感受態(tài)細(xì)菌,篩選菌落和測序鑒定。將重組原核表達(dá)載體pEGX-4T

3、-1/PLB1和pEGX-4T-1/PLB2轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞,在37℃經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)出包涵體融合蛋白。包涵體蛋白尿素中變性復(fù)性后經(jīng)親和層析、陰離子交換層析和反相高效液相層析純化,并用凝血酶酶切標(biāo)簽,得到純化的磷脂酶B1和B2蛋白,并通過凝膠擴(kuò)散法檢測其生物學(xué)活性。
　　 結(jié)果：經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得的目的基因分子量與預(yù)計(jì)相同,并定向插入原核表達(dá)載體pEGX-4T-1中,雙酶切后電泳獲得預(yù)期的磷脂酶B1和B2

4、基因條帶,測序證實(shí)為正確序列。重組原核表達(dá)載體pEGX-4T-1/PLB1和pEGX-4T-1/PLB2的基因工程菌在37℃經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后均表達(dá)出包涵體融合蛋白,其在尿素中變性復(fù)性后經(jīng)純化、酶切后得到目的蛋白,并驗(yàn)證其具有生物學(xué)活性。
　　 結(jié)論：⑴成功構(gòu)建了pEGX-4T-1/PLB1和pEGX-4T-1/PLB2原核表達(dá)載體,將其轉(zhuǎn)化至大腸桿菌后表達(dá)出磷脂酶B1和B2的重組蛋白；⑵重組蛋白變性、復(fù)性后經(jīng)親和層析等純化及凝血