鯽魚肌原纖維結(jié)合型絲氨酸蛋白酶的重組表達(dá)及其酶學(xué)特性研究.pdf

1、魚類肌原纖維結(jié)合型絲氨酸蛋白酶（MBSP）與胰蛋白酶的底物特異性類似，但其熱穩(wěn)定性優(yōu)于哺乳動(dòng)物的胰蛋白酶，可作為胰蛋白酶替代品。另外，在魚糜加工過程中，MBSP降解肌原纖維蛋白是造成魚糜凝膠劣化的主要原因之一。因此，對(duì)魚類MBSP的重組表達(dá)及其酶學(xué)特性研究，可為開發(fā)MBSP作為蛋白質(zhì)質(zhì)譜鑒定中的工具酶及研制魚類MBSP抑制劑提供理論依據(jù)。
　　本文以淡水鯽魚為研究對(duì)象，以鯽魚肌肉中總RNA為模板，采用RT-PCR技術(shù)獲得了鯽魚MB

2、SP基因（MBSP）片段，其開放閱讀框?yàn)?29bp，編碼242個(gè)氨基酸殘基，在其N-末端存在一個(gè)含20個(gè)氨基酸殘基的信號(hào)肽。因此，成熟鯽魚MBSP基因（MBSP2）大小為669bp，編碼222個(gè)氨基酸殘基。通過基因重組技術(shù)將成熟鯽魚MBSP基因片段（MBSP2）整合到畢赤酵母的染色體上，成功構(gòu)建了重組酵母表達(dá)菌株GS115/pPIC9K-MBSP2。將該菌株在搖瓶中用1.0%甲醇進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，在發(fā)酵液上清中可檢測到分子量約36kDa的重

3、組蛋白。Western blotting鑒定該重組蛋白為重組鯽魚MBSP。同時(shí)，PAS染色證明了該重組鯽魚MBSP為糖蛋白。
　　在7L發(fā)酵罐中對(duì)重組酵母表達(dá)菌株GS115/pPIC9k-MBSP2進(jìn)行高密度發(fā)酵，獲得其適宜的工藝條件為：發(fā)酵溫度在28.5-29.5℃之間、pH范圍在5.2-5.8之間、溶氧量保持在30%以上、流加方式為溶氧控制、間斷補(bǔ)加甲醇誘導(dǎo)32h。發(fā)酵結(jié)束時(shí)，發(fā)酵液OD600可達(dá)56.2，菌體濕重為123.9

4、g/L。通過對(duì)不同分離純化技術(shù)進(jìn)行合理組合及其工藝條件的優(yōu)化，建立了一套重組鯽魚MBSP的分離純化工藝流程：7L發(fā)酵罐中發(fā)酵→離心取發(fā)酵液上清→30-60%硫酸銨沉淀→透析→Q-Sepharose陰離子交換層析→超濾脫鹽及濃縮→冷凍干燥。最終獲得了重組鯽魚MBSP的固體產(chǎn)品，可用于酶學(xué)性質(zhì)分析及其應(yīng)用研究。
　　重組鯽魚MBSP的酶學(xué)性質(zhì)研究包括底物特異性、最適溫度和溫度穩(wěn)定性、最適pH和酸堿穩(wěn)定性、酶抑制劑和金屬離子對(duì)其酶活的影

5、響。底物特異性研究表明，重組鯽魚MBSP可水解蛋白質(zhì)中賴氨酸的羧基端肽鍵，而不識(shí)別精氨酸殘基，這與蛋白質(zhì)質(zhì)譜鑒定中的工具酶Lys-C的水解特性相類似；其最適反應(yīng)溫度和pH分別為55℃和pH7.5；該酶具有較好的熱穩(wěn)定性和酸堿穩(wěn)定性；絲氨酸蛋白酶抑制劑及高濃度金屬離子可顯著抑制其活性。此外，重組鯽魚MBSP能快速降解鯽魚肌原纖維蛋白，這與天然鯽魚MBSP特性類似。
　　將重組鯽魚MBSP與蛋白質(zhì)質(zhì)譜鑒定中的工具酶Lys-C的酶學(xué)性質(zhì)