牛胰組織蛋白酶L的酶學(xué)特性及對牛肌原纖維降解作用研究.pdf

1、嫩度是牛肉食用品質(zhì)的最重要指標(biāo)，由肌原纖維和肌內(nèi)結(jié)締組織的結(jié)構(gòu)和生化性質(zhì)所決定。本研究利用蛋白質(zhì)柱層析技術(shù)對牛胰中的組織蛋白酶L進(jìn)行分離純化，在研究其酶學(xué)性質(zhì)的同時，利用蛋白質(zhì)凝膠電泳、透射電鏡、相差光學(xué)顯微鏡等手段觀察純化組織蛋白酶L對牛肌原纖維結(jié)構(gòu)及蛋白水解變化，并討論了該純化酶對牛肉嫩化的潛在機(jī)制，為其宰后成熟嫩化的貢獻(xiàn)提供理論依據(jù)。具體研究內(nèi)容和結(jié)果如下:
　　對牛胰組織蛋白酶L進(jìn)行了純化制備及分子量鑒定。以新鮮牛胰為原料

2、，對組織蛋白酶L進(jìn)行分離純化。牛胰勻漿物經(jīng)酸化粗提，再通過鹽析、透析、濃縮、DEAESephacel陰離子交換、Sephacryl S-100分子排阻、SP Sepharose F.F.陽離子交換、BlueSepharose6 F.F.染料親和、ConA Sepharose親和柱層析等步驟純化，制備0.58 mg純酶，純化倍數(shù)達(dá)530.54。經(jīng)SDS凝膠電泳分析，該酶的分子量被鑒定為29.1 kDa。
　　研究了牛胰組織蛋白酶L的

3、酶學(xué)性質(zhì)。經(jīng)試驗結(jié)果分析，牛胰組織蛋白酶L的最造反應(yīng)溫度為50℃，活性溫度范圍為20-50℃，熱穩(wěn)定性隨溫度升高急劇下降，60℃幾無活性。最適反應(yīng)pH為6.5，活性pH范圍為4.0～7.5，pH3.0～8.0處理1h均能保持70％以上活性。巰基還原劑二硫蘇糖醇(DTT)、L-半胱氨酸均明顯激活了該酶活性，10μmol/L的N-(反式-環(huán)氧丁二?；?-L-亮氨酸-4-胍基丁基酰胺(E-64)可完全抑制其活性。1 mmol/L的Zn2+對酶

4、活性有明顯抑制。該純化酶可水解芐氧羰基-苯丙氨酰-精氨酰-甲基香豆素(Z-Phe-Arg-MCA)，其Km值為3.52μmol/L，Vmax達(dá)到500U/mg;而對芐氧羰基-精氨酰-精氨酰-甲基香豆素(Z-Arg-Arg-MCA)和L-精氨酰-甲基香豆素(L-Arg-MCA)不表現(xiàn)出水解活性。
　　牛胰組織蛋白酶L能降解多種牛肌原纖維蛋白，可破壞牛肉肌原纖維Z線結(jié)構(gòu)。研究了純化牛胰組織蛋白酶L對牛背最長肌的肌原纖維的結(jié)構(gòu)和蛋白降解