章魚腸道產(chǎn)蛋白酶菌的分離鑒定及酶學(xué)特性研究.pdf

1、采用水解透明圈和檢測蛋白酶活力的方法，從章魚腸道中分離出一株產(chǎn)蛋白酶的菌株，對菌株進行了形態(tài)觀察、生理生化實驗和16SrRNA全序列鑒定。研究了菌株的最適發(fā)酵條件，考察了碳源、氮源、發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度、起始pH值等因素對菌株產(chǎn)蛋白酶的影響。同時利用硫酸銨沉淀、離子交換層析等方法分離純化出一種電泳級蛋白酶純品，并對其酶學(xué)特性進行了研究?？疾炝说鞍酌傅姆肿恿?、最適作用溫度、最適作用pH值、熱穩(wěn)定性、金屬離子及抑制劑、酶促動力學(xué)等性質(zhì)。并將菌

2、株應(yīng)用于發(fā)酵章魚下腳料，經(jīng)超濾、陰離子交換層析分離獲得抗氧化多肽。結(jié)果顯示:
　　 1.經(jīng)分離篩選獲得產(chǎn)蛋白酶活性最高的菌株Bacillussp.QDV-3，為革蘭氏陽性菌，桿狀，兩端鈍圓，有芽孢。菌落為乳白色、圓形、凸起、邊緣整齊濕潤的光滑型小菌落。生理生化和16SrRNA全序列鑒定其屬于細(xì)菌，厚壁菌門，桿菌綱，芽孢桿菌目，芽孢桿菌科，芽孢桿菌屬，與彎曲芽孢桿菌Bacillusflexus3xWMARB-5有99.2％的同源性

3、。
　　 2.Bacillussp.QDV-3菌株在以果糖為碳源，蛋白胨為氮源，培養(yǎng)基初始pH值8.0，培養(yǎng)溫度30℃的條件下振蕩培養(yǎng)3.5天時，所產(chǎn)蛋白酶活力最高，培養(yǎng)基中添加Mn2+和Ba2+對菌株產(chǎn)蛋白酶有促進作用，所產(chǎn)蛋白酶在SDS-PAGE電泳上顯示至少有5種蛋白酶，分子量分別為32.4、43.3、61.6、96.6和124.2kDa，蛋白酶的最適作用溫度為50～60℃，最適作用pH值為9.0～11.0，熱穩(wěn)定性及pH

4、值穩(wěn)定性均較好;Mn2+、Mg2+對蛋白酶有一定的激活作用;金屬蛋白酶抑制劑(EDTA)和絲氨酸蛋白酶抑制劑(PMSF)對蛋白酶均有顯著抑制作用，說明粗酶液中既存在金屬蛋白酶也存在絲氨酸蛋白酶。
　　 3.粗酶液經(jīng)硫酸銨沉淀、CelluloseCM-52陽離子交換層析、DEAE-SephadexA50陰離子交換層析3步分離純化，純化倍數(shù)為2.5，活性回收率為12.5％，獲得電泳級純蛋白酶QDV-E，該酶分子量為61.6kD，最適

5、反應(yīng)溫度為40℃，屬中溫酶，最適反應(yīng)pH值為9.0～9.5，為堿性蛋白酶，且在50℃下熱穩(wěn)定性較好。動力學(xué)常數(shù)Km為10mg/mL?？疾炝私饘匐x子及蛋白酶抑制劑對蛋白酶活性的影響，其中Mn2+、Mg2+對其有激活作用。絲氨酸蛋白酶抑制劑可以完全抑制該酶的活性，說明該酶可能是絲氨酸族蛋白酶。
　　 4.章魚下腳料多肽經(jīng)超濾和DEAE-SephadexA50陰離子交換層析分離獲得2個活性組分FⅠ和FⅡ，并對不同多肽濃度下FⅠ和FⅡ的