纖維素酶產(chǎn)生菌的分離鑒定及產(chǎn)酶條件優(yōu)化.pdf

1、纖維素酶是可以協(xié)同降解纖維素為葡萄糖的幾種酶的總稱(chēng)，由葡聚糖內(nèi)切酶（EG）、葡聚糖外切酶（CBH）和β-葡萄糖苷酶（BG）3個(gè)主要成分組成，濾紙酶（FPase）活力則代表各種酶協(xié)同作用后的總酶活力。纖維素酶已經(jīng)在能源、飼料、紡織、食品、工業(yè)洗滌、石油開(kāi)采、農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥等諸多方面得到了實(shí)際的應(yīng)用，因此纖維素酶高產(chǎn)菌的篩選具有重要的研究?jī)r(jià)值。真菌、細(xì)菌和放線(xiàn)菌均可以產(chǎn)生纖維素酶，不同微生物產(chǎn)生各具特色的纖維素酶系。本文研究了產(chǎn)纖維素酶的真菌篩

2、選鑒定和產(chǎn)酶條件優(yōu)化，同時(shí)進(jìn)行了產(chǎn)纖維素酶的沙漠放線(xiàn)菌篩選和多相分類(lèi)鑒定研究。 本研究的第一部分為產(chǎn)纖維素酶的真菌篩選鑒定和產(chǎn)酶條件優(yōu)化。從武漢華中農(nóng)業(yè)大學(xué)的奶牛場(chǎng)采集的9份牛糞堆肥樣品中進(jìn)行產(chǎn)纖維素酶菌株的分離，經(jīng)初步篩選，共分離得到50多株具有纖維素降解能力的菌株，通過(guò)濾紙條降解能力測(cè)定和產(chǎn)酶發(fā)酵實(shí)驗(yàn)最終篩選出一株高產(chǎn)纖維素酶的菌株，編號(hào)為HS-F9。菌株HS-F9在4 d內(nèi)可以將濾紙條完全崩解，產(chǎn)EG、CBH和Fpase的

3、酶活分別達(dá)到了3724.2U/mL、6287.3 U/mL和2731.9U／mL。 菌株HS-F9菌落生長(zhǎng)快，在PDA平板上30℃培養(yǎng)36 h后，菌落直徑達(dá)40-60mm，且在直徑約30mm的圓周處有一輪狀的綠色產(chǎn)孢區(qū)，隨著菌落的擴(kuò)大，產(chǎn)孢區(qū)也逐漸向外擴(kuò)展，培養(yǎng)48h后，菌落幾乎占滿(mǎn)整個(gè)平板。老熟的菌落正面為暗綠色，背面無(wú)色，呈棉絮絲狀。菌絲分枝較多，并具有橫隔，分生孢子橢圓形，表面較粗糙，直接著生在次級(jí)孢子梗上。生長(zhǎng)溫度范圍為

4、20-37℃，最適生長(zhǎng)溫度為30℃，生長(zhǎng)pH范圍為3.0-7.5，最適生長(zhǎng)pH為5.0。 以菌株HS-F9的基因組DNA為模板，用PCR法擴(kuò)增了HS-F9的18S rRNA基因全序列，經(jīng)克隆和測(cè)序，序列全長(zhǎng)為1823 bp，其GenBank號(hào)為FJ598872。通過(guò)BLAST分析，再利用Mega軟件進(jìn)行多序列比對(duì)以及構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，菌株HS-F9與木霉屬的Trichoderma viride聚為同一支，DNAMAN軟件比對(duì)結(jié)果序

5、列同源性達(dá)到了99.82％。根據(jù)以上生理生化鑒定以及分子鑒定結(jié)果，初步確定該菌株為綠色木霉（Trichoderma viride）。 將菌株HS-F9利用CMC-Na培養(yǎng)基液體發(fā)酵進(jìn)行產(chǎn)酶條件的優(yōu)化。研究結(jié)果表明，該菌株的最適產(chǎn)酶條件是：產(chǎn)EG、CBH和FPA的最適碳源均為CMC-Na；EG和CBH在以蛋白胨為唯一氮源時(shí)酶活最高，F(xiàn)Pase則在以黃豆粉為唯一氮源時(shí)酶活最高；產(chǎn)EG、CBH和FPA的最適溫度分別為30℃、30℃和3

6、3℃；產(chǎn)EG、CBH的最適起始pH為3.0，而產(chǎn)FPA的最適起始pH為4.0；產(chǎn)EG和FPase的最適接種量為2％，產(chǎn)CBH的最適接種量達(dá)到了8％；培養(yǎng)時(shí)間均以5-6 d為宜。在最適條件下培養(yǎng)，菌株EG、CBH和FPase的酶活達(dá)到了5275.3 U／mL、8502.1 U／mL和3619.1 U／mL，是未優(yōu)化前的1.42、1.35和1.32倍。 本研究的第二部分為產(chǎn)纖維素酶的沙漠極端環(huán)境放線(xiàn)菌分離篩選及多相分類(lèi)鑒定。從新疆鄯

7、善縣典型沙漠土壤樣品中分離到60多株放線(xiàn)菌菌株，通過(guò)對(duì)其纖維素酶產(chǎn)生定性測(cè)定，發(fā)現(xiàn)有9株沙漠放線(xiàn)菌均可以在以CMC-Na為唯一碳源的培養(yǎng)基上很好地生長(zhǎng)，說(shuō)明其可以產(chǎn)生纖維素酶。采用多相分類(lèi)技術(shù)對(duì)篩選到的產(chǎn)纖維素酶放線(xiàn)菌進(jìn)行了系統(tǒng)的分類(lèi)研究，通過(guò)對(duì)其形態(tài)特征、生理生化特性、細(xì)胞壁化學(xué)組分以及16S rRNA基因序列分析等的研究，結(jié)果表明：9株產(chǎn)纖維素酶的放線(xiàn)菌中有7株屬于鏈霉菌屬（Streptomyces），只有菌株XJSS-08屬于莫拉