纖維素降解菌地衣芽孢桿菌CMC-4的分離鑒定、誘變、產(chǎn)酶條件及酶學(xué)特性研究.pdf

1、纖維素是自然界中分布最廣的一種復(fù)雜多糖，由β-1，4-糖苷鍵以線性模式連接葡萄糖組成盡管存在大量纖維素資源可作為再生能源發(fā)揮巨大潛能，但尚未得以充分利用，同時(shí)浪費(fèi)還造成了環(huán)境污染。纖維素酶是可水解纖維素內(nèi)β-1，4-糖苷鍵并釋放葡萄糖單位的一類(lèi)酶，包括外切葡聚糖苷酶(EC.3.2.1.91)、內(nèi)切葡聚糖苷酶(EC.3.2.1.4)、β-葡萄糖苷酶(EC.3.2.1.21)。纖維素酶的應(yīng)用往往受限于其較低催化效率和較差的酶穩(wěn)定性。由于細(xì)菌

2、具備的生長(zhǎng)速率高、適應(yīng)多種極端環(huán)境能力以及能夠提供更高協(xié)同效率的復(fù)雜糖苷水解酶體系，大量關(guān)于細(xì)菌產(chǎn)纖維素酶的研究在全球范圍內(nèi)展開(kāi)。為了滿足工業(yè)應(yīng)用需求，發(fā)掘新的特殊纖維素酶類(lèi)正變成研究的焦點(diǎn)。細(xì)菌中，芽孢桿菌屬細(xì)菌由于其較高生長(zhǎng)速率、可分解胞外酶的能力以及生物安全性能而被廣泛關(guān)注。近年來(lái)，許多研究已經(jīng)報(bào)道了對(duì)來(lái)自芽孢桿菌屬細(xì)菌纖維素酶的純化和界定，這央中包括B.brevis、 B.pumilus、B.amyoliquefaciens和B

3、acillus subtilis，但關(guān)于地衣芽孢桿菌的研究較少。
　　本研究秸稈還田土壤中初篩獲得一株高效纖維素降解菌CMC-4，根據(jù)菌株形態(tài)、理化性質(zhì)及16S rDNA序列分析，初步鑒定為地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）。以此為出發(fā)菌株，經(jīng)亞硝酸鈉誘變獲得一株穩(wěn)定遺傳的高產(chǎn)纖維素酶突變株CMC-4-3。對(duì)CMC-4和CMC-4-3的產(chǎn)酶條件和酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行比較分析。通過(guò)DNS法測(cè)定兩者的產(chǎn)纖維素酶活力，

4、分別為95.89 U·mL-1和160.29 U·mL-1，突變菌株CMC-4-3較原始菌株CMC-4纖維素酶活力提高67.5％。微生物中胞外纖維素酶產(chǎn)量顯著受如溫度、pH、裝液量和通氣量等因素的影響。研究結(jié)果表明CMC-4和CMC-4-3的最適產(chǎn)酶溫度均為37℃，溫度過(guò)高或過(guò)低會(huì)抑制菌體生長(zhǎng)，從而影響酶的分泌水平。CMC-4的最適產(chǎn)酶pH為7.0，而CMC-4-3為6.0。兩者最適合產(chǎn)酶碳源分別為麥芽糖和葡萄糖，均優(yōu)于羧甲基纖維素鈉，

5、這與先前研究結(jié)果并不一致。而突變前后此種表型的變化可能是因?yàn)檎T變引發(fā)菌株水解二糖的能力下降。此外，CMC-4和CMC-4-3的最適產(chǎn)酶氮源均為蛋白胨，來(lái)自其他研究中的結(jié)果也證實(shí)蛋白胨可顯著促進(jìn)纖維素酶的產(chǎn)生。原始和突變菌株的最適產(chǎn)酶裝液量分別為60 mL/250 mL及80 mL/250 mL，最適產(chǎn)酶接種量也未發(fā)生變化，均為2.0％。以上結(jié)果表明，與CMC-4相比，CMC-4-3一些最適產(chǎn)酶條件，如pH和碳源，發(fā)生了變化。這可能是因?yàn)?/p>

6、誘變使得纖維素酶編碼基因突變或者引發(fā)其他相關(guān)酶基因的突變?cè)斐傻?。影響纖維素酶降解纖維素效率的因素主要包括反應(yīng)pH、溫度、激活劑和抑制劑。由CMC-4和CMC-4-3分泌的纖維素酶在20～80℃寬泛的溫度范圍保持較高活性，并在50℃時(shí)酶活力最高，研究表明在30～70℃孵育2h后，酶活力仍然維持在60％以上。對(duì)于誘變菌株CMC-4-3所產(chǎn)纖維素酶而言，80℃孵育2h后酶活仍在70％以上，但CMC-4纖維素酶則降至40％。誘變使酶活力溫度范圍

7、得以擴(kuò)展，使CMC-4-3所產(chǎn)酶成為耐熱性能較高的特殊纖維素酶。CMC-4-3維持相對(duì)酶活以及保持穩(wěn)定性的能力均優(yōu)于CMC-4。這種在高溫下維持穩(wěn)定性的能力更能滿足某些纖維素水解工業(yè)過(guò)程。酶反應(yīng)pH對(duì)纖維素酶活力影響程度更大，兩個(gè)菌株來(lái)源的纖維素酶均可在pH3.0～9.0范圍水解羧甲基纖維素，且在pH6.0時(shí)表現(xiàn)出最大酶活力。且在最適反應(yīng)pH兩側(cè)酶仍具有較高活力，這也表明來(lái)源于這兩株菌的纖維素酶具有特殊寬泛的pH范圍。在pH4.0～7.

8、4范圍4℃孵育24 h后酶活力仍超過(guò)60％，雖然在pH5.0時(shí)穩(wěn)定性最大。芽孢桿菌屬細(xì)菌纖維素酶最有價(jià)值的特征即為它們?cè)谳^寬泛的溫度和pH范圍保持活性并維持穩(wěn)定，據(jù)此，CMC-4-3有產(chǎn)生耐熱耐酸揮較大作堿的特殊纖維素酶類(lèi)，因此在纖維素水解工業(yè)過(guò)程發(fā)用。本研究還發(fā)現(xiàn)Fe2+，Mg2+、Co2+和K+可以激活目標(biāo)纖維素酶，而其他金屬離子均會(huì)不同程度的抑制酶活性。在所有抑制性離子中，Cu2+和Ca2+抑制水平最大，可使酶活力減少50％左右，