雜色鮑組織蛋白酶L及其內(nèi)源性抑制劑的研究.pdf

1、組織蛋白酶L(EC3.4.22.15)屬于半胱氨酸蛋白酶中的木瓜蛋白酶超家族，廣泛存在于動物、植物、細(xì)菌和病毒等生物體內(nèi)。它不僅在溶酶體內(nèi)的蛋白質(zhì)水解過程中起著非常重要的作用，還參與許多重要的生命活動。目前對高等動物中組織蛋白酶L的作用研究較廣泛，認(rèn)為該酶參與機(jī)體多種生理、病理過程。但在甲殼類動物中，有關(guān)組織蛋白酶L的作用功能了解甚少，值得進(jìn)一步研究。鑒于此本實驗從雜色鮑內(nèi)臟中分離純化了組織蛋白酶L并對其酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了研究，以期為組織蛋

2、白酶L理化性質(zhì)及功能特性的研究奠定基礎(chǔ)，為鮑魚的養(yǎng)殖及加工研究提供理論依據(jù)。
　　 本研究通過硫酸銨鹽析、SP-Sepharose Fast Flow陽離子交換層析、Sephacryl S-200凝膠過濾層析和Hydroxyapatite(CHT-Ⅱ Cartridge)羥基磷灰石預(yù)裝柱層析等步驟首次從雜色鮑內(nèi)臟中分離純化得到了組織蛋白酶L，并對其酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了分析研究。經(jīng)過純化，酶的比活力達(dá)到了3006 U/mg，純化倍數(shù)為1

3、582.1倍，回收率為13.4%。SDS-PAGE、Native-PAGE和凝膠過濾結(jié)果表明，組織蛋白酶L得到了純化且為單體結(jié)構(gòu)，其分子量約為28 kDa。糖蛋白染色實驗表明雜色鮑組織蛋白酶L是一種糖蛋白。酶的最適溫度和最適pH分別為37℃和5.5，且在40℃以下與pH5.0-6.5范圍內(nèi)較穩(wěn)定。底物特異性實驗顯示組織蛋白酶L對半胱氨酸蛋白酶類熒光底物Z-Phe-Arg-MCA有強(qiáng)烈的分解作用，而對組織蛋白酶B的特異性底物Z-Arg-A

4、rg-MCA及其它熒光底物則基本不分解。抑制劑實驗表明半胱氨酸蛋白酶抑制劑E-64能有效抑制組織蛋白酶L的活性，而其它類型的蛋白酶抑制劑則抑制效果不明顯。底物特異性實驗和抑制劑實驗說明該酶是一種半胱氨酸蛋白酶。金屬離子Mn2+、Ba2+和Mg2+對酶有不同程度的激活作用，而Co2+、Cu2+、Zn2+、Fe2+和Ca2+等對酶起抑制作用。37℃下以Z-Phe-Arg-MCA為底物進(jìn)行動力學(xué)實驗，得出Km和kcat值分別為1.21μmol

5、/L和21.33 s-1，催化效率(kcat/Km)為1.8×104(mol/L)-1s-1。利用制備的兔抗雜色鮑組織蛋白酶L多克隆抗血清進(jìn)行免疫印跡實驗，發(fā)現(xiàn)該酶在雜色鮑體內(nèi)廣泛存在，其在性腺、肝胰腺、和腮中分布較多。
　　 通過硫酸銨鹽析、DEAE-Sepharose陰離子交換層析和Sephacryl S-200凝膠過濾層析等方法從雜色鮑內(nèi)臟中分離純化得到一種組織蛋白酶L的內(nèi)源性抑制劑。得率為6.3%，純化倍數(shù)為1447.4