中華絨螯蟹組織蛋白酶D和絲氨酸蛋白酶抑制劑3在螺原體感染過程中的功能研究.pdf

1、中華絨螯蟹(Eriocheir sinensis)俗稱河蟹，是一種重要的經(jīng)濟(jì)蟹類，在我國淡水養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)中占有很大的比重。然而，近年來隨著其養(yǎng)殖規(guī)模的擴(kuò)大和集約化程度的不斷提高，由細(xì)菌、病毒以及寄生蟲等病原引起的各種疾病日益嚴(yán)重，給中華絨螯蟹養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，其中顫抖病是中華絨螯蟹中最嚴(yán)重的病害之一。王文等通過組織病理學(xué)的觀察、細(xì)菌分離培養(yǎng)、分類地位的研究以及人工回感實(shí)驗(yàn)等證實(shí)顫抖病的病原是一種特殊的細(xì)菌——螺原體，并正式將

2、它命名為中華絨螯蟹螺原體（Spiroplasma eriocheiris）。前期研究表明，中華絨螯蟹螺原體主要通過河蟹的鰓或其體表進(jìn)入河蟹體內(nèi)，首先侵染其靶細(xì)胞——血細(xì)胞，再在血細(xì)胞中大量繁殖并隨血液循環(huán)進(jìn)一步侵染河蟹的神經(jīng)和肌肉等組織，最終引起河蟹的顫抖病，進(jìn)而導(dǎo)致河蟹死亡。因此鑒于中華絨螯蟹螺原體的特殊性以及對(duì)河蟹的致病性，對(duì)河蟹的免疫防御機(jī)制做進(jìn)一步研究顯得尤為重要。本碩士論文在前期研究的基礎(chǔ)之上，通過基因克隆、生物信息學(xué)分析、蛋

3、白原核表達(dá)、基因干擾，研究?jī)煞N河蟹蛋白即組織蛋白酶D和絲氨酸蛋白酶抑制劑3(EscatD和Esserpin-3)在螺原體侵染河蟹的免疫反應(yīng)機(jī)制中發(fā)揮的作用。本論文將為進(jìn)一步探究螺原體在侵染過程中的河蟹免疫防御機(jī)理以及減少螺原體對(duì)河蟹養(yǎng)殖業(yè)的危害提供一定的理論依據(jù)。本論文研究結(jié)果主要包括以下三個(gè)方面:
　　1.EscatD基因克隆、生物信息學(xué)分析、蛋白原核表達(dá)以及相關(guān)功能的研究
　　以河蟹的血細(xì)胞cDNA為模板，通過PCR成功

4、擴(kuò)增了中華絨螯蟹組織蛋白酶D(EscatD)。該基因的cDNA全長(zhǎng)序列為2748bp，其中5'非翻譯區(qū)(UTR)140bp，3'UTR1450bp，開放閱讀框1158bp，編碼385個(gè)氨基酸，分子量約為41.66kDa，等電點(diǎn)為6.53。序列分析表明，EscatD蛋白由信號(hào)肽、前體域和成熟域3部分組成。同源性分析表明，EscatD的氨基酸序列高度保守，與水生甲殼類動(dòng)物相似性在80％以上。進(jìn)化分析表明，EscatD與蝦類的親緣關(guān)系比較近，

5、與傳統(tǒng)分類結(jié)果基本一致。構(gòu)建了原核表達(dá)質(zhì)粒pET-28a-EscatD，誘導(dǎo)表達(dá)獲得了以包涵體形式存在的重組蛋白EscatD。組織表達(dá)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，EscatD在被檢測(cè)的所有器官中都有表達(dá)，其中在河蟹的眼柄、血細(xì)胞、腸和神經(jīng)組織中表達(dá)量都相對(duì)較高，在心臟、肌肉和鰓中的表達(dá)量較少。上述結(jié)果為進(jìn)一步開展EscatD的功能研究奠定重要基礎(chǔ)。
　　2.EscatD免疫功能的初步研究
　　EscatD屬于組織蛋白酶D家族的一員，近期的研究

6、表明EscatD蛋白在甲殼動(dòng)物的先天性免疫反應(yīng)中發(fā)揮著重要的作用。qRT-PCR結(jié)果顯示，在螺原體刺激河蟹血細(xì)胞后，EscatD mRNA的轉(zhuǎn)錄明顯高于對(duì)照組（PBS組）。靶基因干擾后，EscatD下游基因JNK、ERK、P38和Relish的基因表達(dá)量均有所下降，螺原體感染河蟹的血細(xì)胞后，與陽性對(duì)照組相比螺原體的拷貝數(shù)明顯增加，河蟹死亡率明顯升高，進(jìn)一步說明EscatD在河蟹應(yīng)對(duì)螺原體的刺激中發(fā)揮著重要的免疫作用。
　　3.Es

7、serpin-3免疫功能的初步研究
　　Esserpin-3屬于絲氨酸蛋白酶抑制劑3家族的一員，近期的研究表明Esserpin-3蛋白在甲殼類的先天性免疫反應(yīng)中發(fā)揮著重要的作用。qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)表明，螺原體刺激河蟹血細(xì)胞后，Esserpin-3mRNA的轉(zhuǎn)錄明顯高于對(duì)照組（PBS組）。靶基因干擾后，Esserpin-3的上游基因LGBP的表達(dá)量升高，下游基因proPO的表達(dá)量升高;螺原體感染河蟹血細(xì)胞后，與陽性對(duì)照組相比螺原