稻瘟病菌幾丁質(zhì)酶和絲氨酸蛋白酶之水稻受體研究.pdf

1、稻瘟病菌(Magnaporthe orzae)引起水稻重要病害，是研究植物與病原微生物相互作用的重要模式生物。已知其在侵染水稻時(shí)分泌幾丁質(zhì)酶、絲氨酸蛋白酶，參與致病過(guò)程。前期研究表明稻瘟病菌幾丁質(zhì)酶和絲氨酸蛋白酶可能是稻瘟病的致病因子，然而，它們?cè)诓〕讨械淖饔脵C(jī)制未明，特別是如何介導(dǎo)寄主水稻的響應(yīng)，尚無(wú)報(bào)道。本文利用酵母雙雜交系統(tǒng)以稻瘟病菌幾丁質(zhì)酶、絲氨酸蛋白酶作為誘餌蛋白，從水稻中篩選受體，研究?jī)蓚€(gè)蛋白與候選受體的互作關(guān)系，并探討候選

2、受體水稻RNAi突變體在與稻瘟病菌互作過(guò)程的變化，從而進(jìn)一步明確它們?cè)诳共』蛑虏∵^(guò)程中的作用。 酵母雙雜交獲得與稻瘟菌幾丁質(zhì)酶(MoChil)互作的陽(yáng)性克隆18個(gè)，與稻瘟病菌絲氨酸蛋白酶(MoSPl)互作的陽(yáng)性克隆12個(gè)，同時(shí)測(cè)序并對(duì)他們進(jìn)行生物信息學(xué)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)MoChil和MoSPl篩選到了同一個(gè)受體甘露糖凝集素OsMbl1。通過(guò)GST pull-down驗(yàn)證了MoChil可以與水稻甘露糖凝集素OsMbl1、金屬硫蛋白Os

3、Mtll和MoSPl與鋅指蛋白OsZfpl、甘露糖凝集素OsMbl1及All體外互作。Western bloting結(jié)果表明MoClul與OsMbl1和OsMtll間存在相互作用；MoSPl可以與OsZfpl、OsMbl1體外互作，但不能與All體外互作。 本文重點(diǎn)研究了OsMbl1分別與MoChil和MoSPl互作結(jié)構(gòu)域。首先，生物信息學(xué)分析表明，OsMBL1含有單子葉植物甘露糖結(jié)合凝集素家族結(jié)構(gòu)域，且該結(jié)構(gòu)域含有三個(gè)糖結(jié)合位

4、；與蒜、石斛、文殊蘭屬等其他單子葉植物甘露糖結(jié)合凝集素的序列一致性大于50％，并具有單子葉植物甘露糖結(jié)合凝集素保守酸性氨基酸的結(jié)合位點(diǎn)。通過(guò)構(gòu)建OsMBL1不同片段缺失突變體，經(jīng)GST pull-down方法來(lái)檢測(cè)其與MoChil和MoSPl的互作特性，結(jié)果表明在與幾丁質(zhì)酶互作的過(guò)程中他的三個(gè)結(jié)合位點(diǎn)G……GXXXD、GXGXXXEDE和GX[GAVIYWF][DNEW]是相互獨(dú)立的，都能各自發(fā)揮作用。然而它與絲氨酸蛋白酶互作結(jié)果卻表明

5、只有這三個(gè)位點(diǎn)同時(shí)存在時(shí)才能表現(xiàn)出活性。 本文還分析了MoSPl與OsZfpl的互作結(jié)構(gòu)域。生物信息學(xué)分析表明，OsZFPl含有一個(gè)C3HC4保守結(jié)構(gòu)域，C端位置有兩個(gè)跨膜螺旋序列，編碼α/β型、非分泌型蛋白。缺失突變和GST Pull-down分析表明，OsZfpl與絲氨酸蛋白酶的互作只需要其C3HC4結(jié)構(gòu)域，其N(xiāo)端和C端不是它們互作所必須的。 利用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)檢測(cè)OsZFP1、All和OsMBL1基因在幾丁質(zhì)酶

6、和絲氨酸蛋白酶敲除突變體和野生型Guy11侵染后的水稻葉片中的表達(dá)情況，結(jié)果表明，在絲氨酸蛋白酶敲除突變體侵染后的水稻葉片中表達(dá)量與在野生型侵染后的水稻葉片中的表達(dá)量相比，OsMBL1在72小時(shí)前表現(xiàn)為下調(diào)，在96小時(shí)后表現(xiàn)為上調(diào)：OsZFPl都表現(xiàn)為下降；而All基因的表達(dá)量無(wú)多大差異。OsMBL1基因在幾丁質(zhì)酶敲除突變體侵染后的水稻葉片中的表達(dá)量先表現(xiàn)為下調(diào)，48小時(shí)后達(dá)到最小，接著又有所回升。與野生型侵染后的水稻葉片中的表達(dá)量相比