稻瘟病菌Rho族GTP酶功能分析.pdf

1、Rho族蛋白是Ras超家族最主要成員之一，已發(fā)現(xiàn)的有Rho、Rac、Cdc42三個亞家族近百種蛋白。大量研究結果表明，Rho族蛋白在調(diào)控與肌動蛋白骨架相關的信號轉(zhuǎn)導途徑，并參與MAP激酶的細胞信號轉(zhuǎn)導過程，起著調(diào)節(jié)細胞極性、細胞運動、細胞增殖、細胞凋亡、基因轉(zhuǎn)錄、細胞周期、微管活力、細胞轉(zhuǎn)化、囊狀運輸途徑、從吞噬細胞的NADPH氧化酶至酵母中葡聚糖合成酶等一系列酶活性、惡性腫瘤細胞的浸潤和轉(zhuǎn)移等重要作用。在真菌中，幾乎所有Rho族蛋白都

2、被證實參與調(diào)控細胞極性生長，其還參與調(diào)控細胞壁合成及其完整性、胞外分泌、細胞分化等；在絲狀真菌中其還參與調(diào)控侵染致病過程。 稻瘟病菌(Magnaporthegrisea)是研究絲狀真菌的重要模式生物，也是引起水稻重要病害稻瘟病的病原菌。該菌侵染循環(huán)過程經(jīng)歷了分生孢子萌發(fā)、附著胞分化、侵入栓的形成以及侵染生長，這一過程涉及復雜的細胞分化、信號轉(zhuǎn)導和極性生長。 數(shù)據(jù)庫分析結果表明，稻瘟病菌基因組中有7個Rho族蛋白成員，且通

3、過基因表達分析表明這7個Rho族蛋白在稻瘟病菌中均可表達，因而我們推測這些Rho族蛋白在稻瘟病菌生長發(fā)育以及侵染致病過程中可能起著極為關鍵的作用。本論文選擇了具有代表性的兩個Rho族蛋白成員(MgCdc42和MgRho3)，深入開展了功能分析。 MgCdc42在稻瘟病菌分生孢子中表達最強，通過構建插入失活突變體、持續(xù)激活突變體、負顯性失活突變體以及過量表達突變體，分析了MgCdc42在稻瘟病菌中的功能。研究結果表明，MgCdc4

4、2插入失活突變導致稻瘟病菌侵入栓形成受抑，從而引起致病性顯著下降；產(chǎn)孢量減少，分生孢子形態(tài)異常，氣生菌絲生長受抑，菌絲異常；在疏水性表面分生孢子萌發(fā)延遲，附著胞形成滯后、減少，且附著胞異常。而MgCdc42負顯性突變的結果與MgCdc42插入失活突變結果十分相似，最終也導致了稻瘟病菌分生孢子、營養(yǎng)菌絲異常，附著胞形成受抑，并導致了侵染能力下降。MgCdc42持續(xù)激活突變體之分生孢子正常，但其菌絲末端分枝增多，附著胞形成減少且侵染能力也大

5、為下降。與這些突變體不同的是，MgCdc42過量表達突變體與稻瘟病菌野生型菌株之表型及侵染致病能力差異不顯著。這些結果表明MgCdc42調(diào)控著稻瘟病菌細胞分化、極性生長以及其侵染致病過程。 MgRho3在稻瘟病菌分生孢子萌發(fā)階段表達最強，通過構建插入失活突變體以及過量表達突變體，其在稻瘟病菌中的功能也得以解析。研究結果表明，MgRho3插入失活突變體侵染致病能力也顯著下降，但與MgCdc42插入失活導致稻瘟病菌侵入栓形成受抑，并

6、引起致病性顯著下降不同的是，似乎MgRho3插入失活導致稻瘟病菌附著胞形成嚴重受抑，而引起侵染力下降。MgRho3插入失活還促使稻瘟病菌分生孢子從倒梨形改變?yōu)殚L橢圓形，產(chǎn)孢量減少；分生孢子萌發(fā)延遲，附著胞形成滯后且降低；菌絲末端分枝增多。與MgCdc42過量表達突變體不同的是，MgRho3過量表達突變體侵染能力提高，其可能是MgRho3過量表達突變體分生孢子可產(chǎn)生雙附著胞引起的。MgRho3過量表達突變體產(chǎn)孢量有所提高，附著胞形成提前，

7、菌絲末端分枝增多。以上結果表明了，與MgCdc42相似，MgRho3也調(diào)控著稻瘟病菌細胞分化、極性生長和侵染致病的過程。洋蔥表皮侵染結果表明洋蔥表皮對于MgRho3插入失活突變體的侵染失去了反應，而野生型菌株與過量表達突變體接種后的洋蔥表皮都能產(chǎn)生強烈的自發(fā)熒光，這似乎預示著MgRho3在稻瘟病菌與植物互作中的信號傳導中起著關鍵作用。 本論文還通過基因表達分析以及功能分析，初步明確了MgRho3與MgCdc42的關系。MgCdc

8、42過量表達未能恢復稻瘟病菌因MgRho3插入失活而引起的生長發(fā)育以及侵染致病的缺陷。但MgRho3過量表達在很大程度上互補了稻瘟病因MgCdc42插入失活而引起的表型缺陷。綜合基因表達以及功能分析之結果，我們推測MgRho3可能處在MgCdc42上游起作用，但兩者可能不只是簡單的上、下游關系，對此本文也進行了簡單的探討。 此外，通過分析稻瘟病菌基因組數(shù)據(jù)庫，以及綜合其他學者在酵母上研究的結果，分析了稻瘟病菌MgCdc42可能的