通過(guò)RNA干擾方法研究稻瘟病菌幾丁質(zhì)酶家族基因的功能.pdf

1、幾丁質(zhì)是真菌細(xì)胞壁的主要組成成分，幾丁質(zhì)的分解合成影響細(xì)胞壁動(dòng)態(tài)變化。真菌幾丁質(zhì)酶通過(guò)分解幾丁質(zhì)影響真菌形態(tài)建成,生長(zhǎng)發(fā)育和致病毒力等。稻瘟病菌在菌絲生長(zhǎng)，附著胞形成，芽管萌發(fā)，侵染擴(kuò)展等生長(zhǎng)階段都涉及細(xì)胞分裂分化，即與幾丁質(zhì)酶相關(guān)。因此研究幾丁質(zhì)酶基因功能有助于深入了解稻瘟病菌與水稻互作機(jī)制。
　　稻瘟病菌幾丁質(zhì)酶家族基因有15個(gè)，可能存在功能冗余，通過(guò)基因敲除的方法研究其生物功能研究有一定難度。因此，本研究通過(guò)構(gòu)建RNA干擾載

2、體，同時(shí)沉默多個(gè)基因，以分析稻瘟病菌幾丁質(zhì)酶基因在致病過(guò)程中的作用。從預(yù)測(cè)的15個(gè)幾丁質(zhì)酶基因中分別選擇60 bp的特異序列，串聯(lián)合成900 bp DNA片段，構(gòu)建RNAi載體。將RNAi載體轉(zhuǎn)化稻瘟病菌原生質(zhì)體獲得RN Ai轉(zhuǎn)化子。實(shí)時(shí)定量PCR的分析結(jié)果表明，RNAi突變體中多個(gè)幾丁質(zhì)酶基因 mRNA轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)。
　　幾丁質(zhì)酶家族基因的功能分析結(jié)果如下：與野生型相比，RNAi突變體菌落生長(zhǎng)速率略微降低，菌落黑色素減少，分生孢

3、子梗數(shù)與產(chǎn)孢量下降，孢子長(zhǎng)寬比增加，萌發(fā)異常，且分生孢子萌發(fā)與附著胞形成略微延遲。同時(shí)，RNAi突變體菌絲細(xì)胞壁幾丁質(zhì)分布有變化，細(xì)胞壁敏感性受到影響。盡管RNAi突變體的致病性沒有完全喪失，但侵染葉片的病斑顏色較淺，病斑數(shù)降低。幾丁質(zhì)酶基因的沉默導(dǎo)致RNAi突變體生長(zhǎng)發(fā)育和形態(tài)建成異常，不同突變體幾丁質(zhì)酶基因沉默效率不一，引起RNAi突變體之間的表型有差異。
　　綜上所述，稻瘟病菌幾丁質(zhì)酶家族基因共同參與調(diào)控菌絲的生長(zhǎng)、產(chǎn)孢、幾