中國明對蝦絲氨酸蛋白酶基因的研究.pdf

1、中國明對蝦是我國重要的海產(chǎn)養(yǎng)殖品種，在沿海地區(qū)海產(chǎn)品養(yǎng)殖中占有重要的經(jīng)濟(jì)地位。然而，自上世紀(jì)90年代以來，對蝦疾病頻繁爆發(fā)，使海產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)遭受巨大損失。解決這一問題除環(huán)境因素外，提高對蝦自身免疫力和抗病力是一個很重要的方面。因此只有了解了對蝦的免疫機(jī)制才能為其疾病控制提供有效的方法。 在無脊椎動物中，絲氨酸蛋白酶調(diào)控多種防御反應(yīng)，包括血淋巴凝結(jié)、抗菌肽合成和在病原體表面形成黑化包囊。這些過程都需要血淋巴中的絲氨酸蛋白酶的參與，當(dāng)受

2、到病原體的感染，絲氨酸蛋白酶可以迅速激活免疫應(yīng)答途徑。 本論文以中國明對蝦絲氨酸蛋白酶這個與對蝦先天免疫相關(guān)的基因為研究對象，應(yīng)用一系列的生物化學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)，進(jìn)行基因克隆、組織分布以及表達(dá)研究，試圖從一定層面上了解對蝦的免疫機(jī)制，為對蝦疾病的防治提供理論依據(jù)。 1、首次克隆得到了中國明對蝦絲氨酸蛋白酶全長基因。 利用同源克隆的方法，從中國明對蝦血細(xì)胞中克隆得到了中國明對蝦絲氨酸蛋白酶全長cDNA，全長106

3、5bp，開放閱讀框(ORF)為1020bp，編碼339個氨基酸，由信號肽、一個發(fā)夾結(jié)構(gòu)域(Clip domam)和胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶結(jié)構(gòu)域(Tryp_SPc domam)構(gòu)成。 2、應(yīng)用RT-PCR，Northem Blot和原位雜交方法，對中國明對蝦絲氨酸蛋白酶在中國明對蝦中的表達(dá)和分布進(jìn)行了研究。 RT-PCR和Northerm Blot結(jié)果顯示，中國明對蝦絲氨酸蛋白酶在對蝦的血細(xì)胞和鰓中發(fā)生轉(zhuǎn)錄，而在其它組

4、織中無表達(dá)，并且結(jié)果還顯示，在細(xì)菌刺激的中國明對蝦血細(xì)胞中和鰓中，絲氨酸蛋白酶基因表達(dá)下調(diào)。推測該基因可能與免疫防御有關(guān)。 原位雜交結(jié)果顯示，絲氨酸蛋白酶基因只在血細(xì)胞中表達(dá)，在中國明對蝦鰓中的陽性信號也是源自血細(xì)胞。 3、中國明對蝦絲氨酸蛋白酶原核表達(dá)研究。本文構(gòu)建了中國明對蝦絲氨酸蛋白酶表達(dá)載體sp-pET-30a(+)，并在大腸桿菌BL21(DE3)菌株中成功表達(dá)了目的蛋白，并應(yīng)用親和層析的方法純化到了高純度的重