絲氨酸蛋白酶在新生隱球菌感染中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、新生隱球菌是一種環(huán)境致病菌，在艾滋病患者和CD4+T細(xì)胞缺陷者中常見，易導(dǎo)致隱球菌腦膜炎。艾滋病感染患者中每年有100萬(wàn)人新增隱球菌患者，大約有62.5萬(wàn)人死于隱球菌腦膜炎相關(guān)疾病。37℃生長(zhǎng)，莢膜，黑色素，尿素酶等是目前已知的新生隱球菌的毒力因子。研究新生隱球菌的毒力因子以及它們之間如何相互作用，對(duì)于控制隱球菌感染的蔓延具有重要意義。
　　絲氨酸蛋白酶和天冬氨酸蛋白酶是常見的蛋白水解酶類，廣泛的分布在自然界的生物中，包括病毒、細(xì)

2、菌、真菌和動(dòng)植物。天冬氨酸蛋白酶參與很多重要生理過(guò)程。在動(dòng)物中，腎素是一種天冬氨酸蛋白酶，其可以通過(guò)腎素-血管緊張素系統(tǒng)調(diào)節(jié)血壓;逆轉(zhuǎn)錄病毒天冬氨酸蛋白酶，如HIV蛋白酶，是病毒顆粒的成熟必不可少的，其抑制劑是治療AIDS成熟的藥物;白色念珠菌分泌的天冬氨酸蛋白酶參與粘附過(guò)程和組織的滲透，并與宿主的免疫系統(tǒng)的相互作用。絲氨酸蛋白酶的生理功能包括血液凝結(jié)，細(xì)胞和體液免疫，纖維蛋白溶解，受精，胚胎發(fā)育，蛋白質(zhì)加工和組織。在皮膚癬菌中，絲氨酸

3、蛋白酶可能參與皮膚癬菌對(duì)宿主的粘附過(guò)程。
　　新生隱球菌蛋白酶被認(rèn)為是隱球菌的潛在毒力因子，但是其在隱球菌感染中的作用和地位還未明確。目前已有隱球菌外分泌的蛋白酶被鑒定和分離出來(lái)。最近的研究表明隱球菌的一種金屬蛋白酶Mpr1在隱球菌通過(guò)血腦屏障過(guò)程中扮演著重要的角色。新生隱球菌絲氨酸蛋白酶被證實(shí)可以分解纖維連接蛋白，可能在隱球菌通過(guò)血腦屏障中發(fā)揮作用。
　　在本文的研究中，我們首先通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序比較了新生隱球菌在體內(nèi)腦脊液，

4、體外腦脊液及體外YPD轉(zhuǎn)錄組表達(dá)的不同，結(jié)合MEROPS數(shù)據(jù)庫(kù)，篩選出可能在新生隱球菌感染中發(fā)揮作用的6個(gè)絲氨酸蛋白酶編碼基因和5個(gè)天冬氨酸蛋白酶編碼基因。為了研究這11個(gè)基因在隱球菌感染中的作用，我們通過(guò)Cre-LoxP系統(tǒng)構(gòu)建了天冬氨酸蛋白酶和絲氨酸蛋白酶的單基因和多基因缺陷株:ser1△, ser2△，ser3△，ser4△, ser5△,ser6△,ser M2△,ser M3△,ser M4△,ser M5△,ser M5△+

5、SER3, serM5△+SER5, asp1△,asp2△, asp3△,asp4△,asp5△,asp M2△,asp M3△, asp M4△,aspM5△。通過(guò)體外的應(yīng)激應(yīng)答實(shí)驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)天冬氨酸蛋白酶缺陷株的表型缺陷并不明顯，于是我們將焦點(diǎn)集中在絲氨酸蛋白酶。我們發(fā)現(xiàn)絲氨酸蛋白酶Ser5參與新生隱球菌黑色素的誘導(dǎo)和生成。serM5△多基因缺陷株對(duì)體外細(xì)胞壁壓力敏感，其基因缺陷可能影響細(xì)胞壁的完整性，同時(shí)serM5△表現(xiàn)出尿素酶

6、活性和蛋白酶活性下降。但是長(zhǎng)時(shí)間的培養(yǎng)顯示ser M5△并沒有完全丟失尿素酶和蛋白酶活性。在小鼠尾靜脈感染中，serM5△在腦部的菌荷量顯著下降，可能與其通過(guò)血腦屏障障礙有關(guān)。在小鼠吸入模型中，serM5△感染小鼠的生存率并沒有明顯的延長(zhǎng)，可能與serM5△并沒有完全丟失蛋白酶活性相關(guān)。
　　本實(shí)驗(yàn)對(duì)天冬氨酸蛋白酶及絲氨酸蛋白酶的相關(guān)基因進(jìn)行了一個(gè)宏觀的篩查，并對(duì)感興趣的基因進(jìn)行了表性和毒力的檢測(cè)，試圖探討新生隱球菌特定蛋白酶與隱