粘蟲(chóng)(Mythimna separata)中腸絲氨酸蛋白酶cDNA的克隆及功能鑒定.pdf

1、絲氨酸蛋白酶(Serine Proteases，SPs)是一類(lèi)以絲氨酸為活性中心的重要的蛋白水解酶，主要包括胰蛋白酶(EC號(hào):3.4.21.4)和胰凝乳蛋白酶(EC號(hào):3.4.21.1)。絲氨酸蛋白酶是鱗翅目昆蟲(chóng)中最主要的消化酶，約占鱗翅目昆蟲(chóng)中腸總消化酶活性的95％，在鱗翅目昆蟲(chóng)的生理過(guò)程以及生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中起著重要的作用，主要參與食物消化、蛻皮過(guò)程和先天免疫反應(yīng)等重要的生理過(guò)程。此外，一些研究證明，鱗翅目昆蟲(chóng)中腸絲氨酸蛋白酶參與Bt原

2、毒素活化和毒素降解過(guò)程，昆蟲(chóng)對(duì)Bt產(chǎn)生抗性有可能依賴于昆蟲(chóng)腸道中絲氨酸蛋白酶表達(dá)水平或類(lèi)型（例如胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶）的變化。因此鱗翅目昆蟲(chóng)中腸的絲氨酸蛋白酶一直是研究的熱點(diǎn)，逐漸成為害蟲(chóng)防治的靶標(biāo)，為新一代殺蟲(chóng)劑的研發(fā)提供了一個(gè)方向。粘蟲(chóng)Mythimnaseparata是亞洲國(guó)家糧食作物的重大害蟲(chóng)，為了探索絲氨酸蛋白酶在粘蟲(chóng)體內(nèi)的作用，本研究從粘蟲(chóng)幼蟲(chóng)中腸克隆得到一條胰蛋白酶類(lèi)絲氨酸蛋白酶基因和一條胰凝乳蛋白酶類(lèi)絲氨酸蛋白酶基因，分

3、別命名為MsT（GenBank登錄號(hào):KP730443）和MsCT(GenBank登錄號(hào):KP730444)，并將MsT和MsCT基因進(jìn)行了原核表達(dá)和活性測(cè)定。同時(shí)，對(duì)MsT基因和MsCT基因在不同組織和不同發(fā)育階段的轉(zhuǎn)錄水平，對(duì)于饑餓處理及再喂食后的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，對(duì)于蛻皮激素(20E)的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)以及對(duì)于Cry1AC原毒素的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)都做了研究。最后，通過(guò)注射雙鏈RNA檢測(cè)了MsT和MsCT基因的RNA干擾效果。主要研究結(jié)果如下:
　　

4、1.MsT基因cDNA序列長(zhǎng)856bp，開(kāi)放閱讀框(ORF)長(zhǎng)765bp，編碼255個(gè)氨基酸，蛋白質(zhì)分子量為27.1kDa，等電點(diǎn)為9.04。由MsT推導(dǎo)出的氨基酸序列與鱗翅目昆蟲(chóng)絲氨酸蛋白酶的氨基酸序列一致性在50％～84％之間，其中與蓓帶夜蛾Mamestra configurata(GenBank登錄號(hào):ACR15970)胰蛋白酶類(lèi)絲氨酸蛋白酶的氨基酸序列一致性最高，達(dá)84％。
　　2.MsCT基因cDNA序列長(zhǎng)971bp，開(kāi)

5、放閱讀框(ORF)長(zhǎng)891bp，編碼297個(gè)氨基酸，蛋白質(zhì)分子量為31.0kDa，等電點(diǎn)為8.63。由MsCT推導(dǎo)出的氨基酸序列與鱗翅目昆蟲(chóng)絲氨酸蛋白酶的氨基酸序列一致性在44％～84％之間，其中與蓓帶夜蛾M.configurata（GenBank登錄號(hào):ACR15972）胰凝乳蛋白酶類(lèi)絲氨酸蛋白酶的氨基酸序列一致性最高，達(dá)84％。
　　3.分別構(gòu)建重組載體Ms T-pET21b和MsCT-pET21b轉(zhuǎn)化到大腸桿菌菌株E.col

6、i BL21中進(jìn)行原核表達(dá)，經(jīng)過(guò)SDS-PAGE和Western blot檢測(cè)確定為目的蛋白。蛋白可溶性分析發(fā)現(xiàn)重組蛋白為包涵體。將重組蛋白經(jīng)過(guò)變性、純化和復(fù)性處理后，以BApNA為底物，進(jìn)行活性測(cè)定。結(jié)果表明，在Tris-HCl緩沖液中，重組蛋白的活性隨著pH的提高而增大，到pH為9.5時(shí)，活性達(dá)到23.24U/mL;在Glycine-NaOH緩沖液中，重組蛋白的活性隨著pH的變化先升高后降低，在pH為10.0時(shí)，活性達(dá)到最高，為35

7、.74U/mL。
　　4.明確了MsT和MsCT基因在粘蟲(chóng)不同組織和不同發(fā)育階段的轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在粘蟲(chóng)的前腸、中腸、馬氏管、脂肪體和圍食膜都發(fā)現(xiàn)了MsT和MsCT基因的轉(zhuǎn)錄，特別是在圍食膜中，它們的轉(zhuǎn)錄水平達(dá)到最高;MsT和MsCT基因都主要在末齡幼蟲(chóng)、預(yù)蛹和蛹的階段表達(dá)，MsT基因在蛹期表達(dá)量最高，而MsCT基因在末齡幼蟲(chóng)、預(yù)蛹和蛹期表達(dá)量相差不大。
　　5.明確了MsT和MsCT基因?qū)τ陴囸I處理及再喂食后的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。

8、結(jié)果發(fā)現(xiàn)饑餓處理24h后，MsT和MsCT基因的表達(dá)量都明顯降低;同時(shí)，饑餓處理的幼蟲(chóng)通過(guò)再次喂食后，MsT和MsCT基因的表達(dá)量又顯著升高。這些結(jié)果表明，MsT和MsCT基因可能在粘蟲(chóng)的食物消化過(guò)程中起到某種作用。
　　6.明確了MsT和MsCT基因?qū)τ谕懫ぜに?20E)的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)與對(duì)照相比，MsT基因的表達(dá)量在6齡幼蟲(chóng)注射2μg蛻皮激素12h后顯著升高，在24h后表達(dá)量達(dá)到最高;而MsCT基因的表達(dá)量在注射2μg蛻皮

9、激素24h后顯著降低。這些結(jié)果表明，MsT基因可能在粘蟲(chóng)的蛻皮過(guò)程中起到某種作用。
　　7.明確了MsT和MsCT基因?qū)τ贑ry1AC原毒素的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)與對(duì)照相比，MsT基因的表達(dá)量不受Cry1Ac原毒素的影響，而MsCT基因的表達(dá)量在3齡幼蟲(chóng)喂食用Cry1Ac原毒素浸泡過(guò)的玉米葉24h后顯著升高。這些結(jié)果表明，MsCT基因可能在Bt原毒素的活化過(guò)程中起到某種作用。
　　8.MsT和MsCT基因的RNA干擾研究表明，