變異鏈球菌ClpCP蛋白酶作用機制的初步研究.pdf

1、目的：
　　Clp蛋白酶廣泛存在于各種生物體，尤其是低GC含量的革蘭陽性菌中。研究發(fā)現(xiàn)在外界應(yīng)激條件下，Clp蛋白酶可以通過重新折疊或降解的方式，對錯誤折疊并累積的蛋白質(zhì)進(jìn)行修正或者清除。研究發(fā)現(xiàn)，Clp蛋白酶由催化亞基和調(diào)節(jié)亞基構(gòu)成，其中催化亞基為含有絲氨酸蛋白酶活性位點的ClpP蛋白，調(diào)節(jié)亞基為存在于細(xì)菌中高度保守的Clp ATP酶。
　　ClpC作為Clp ATP酶的重要成員之一，可與ClpP蛋白發(fā)生特異性結(jié)合形成Cl

2、pCP，參與由McsAB介導(dǎo)的熱休克蛋白CtsR的降解。在枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis,B.subtilis）中，ClpCP蛋白酶可借由MecA蛋白的介導(dǎo)參與其感受態(tài)形成系統(tǒng)ComK/S的轉(zhuǎn)錄，調(diào)控B.subtilis感受態(tài)細(xì)胞的形成。研究證實，變異鏈球菌(Streptococcus mutans,S.mutans)與B.subtilis同為低GC含量的革蘭陽性菌，且Clp蛋白水解系統(tǒng)具有較高的同源性。同源性比對證實

3、，變異鏈球菌中存在著ClpP和五種Clp ATP酶，包括：ClpB、ClpC、ClpE、ClpL和ClpX。因此，本研究擬構(gòu)建變異鏈球菌S.mutans的clpP/clpC基因缺陷株，并通過細(xì)菌形態(tài)、生長曲線、平板生存試驗、適應(yīng)性耐藥、生物膜形成試驗、感受態(tài)基因表達(dá)測定、感受肽細(xì)胞轉(zhuǎn)化率等初步探討Clp蛋白酶在變異鏈球菌應(yīng)激耐受中的作用及其相關(guān)機制。
　　方法:
　?。?）本研究以變異鏈球菌UA159作為實驗菌株，PCR擴增

4、clpP、clpC基因片段，分別插入pMD-19T simple克隆載體，并連入卡那霉素抗性基因盒（lox71-kan-lox66），從而構(gòu)建clpP和clpC缺失同源重組載體pCKX3和pCKX4。
　　（2）在感受態(tài)刺激肽（competence-stimulating peptide,CSP）作用下，將線性化的pCKX3和pCKX4分別轉(zhuǎn)化變異鏈球菌 UA159，獲得△clpC::kan和△clpP::kan菌株，同樣方法轉(zhuǎn)化

5、熱敏質(zhì)粒 pCrePA，37℃培養(yǎng)去除pCrePA并獲得無標(biāo)記缺陷株SM-△clpP和SM-△clpC。
　?。?） PCR擴增clpP基因開放閱讀框（open reading frame，ORF）及其5’UTR，插入pOri23并轉(zhuǎn)化SM-?clpP突變菌株，獲得補償株SclpP。
　?。?）以生長時間為橫坐標(biāo)，OD600值為縱坐標(biāo)繪制生長曲線，觀察各菌株的
　　生長情況。
　?。?）以pH5.0、6.0、8.

6、0和1％NaCl、2.5%NaCl的THY平板進(jìn)行生存測試，比較各菌株的生存能力。
　?。?）將各菌株分別培養(yǎng)于0.5%葡萄糖的THY液和0.5%蔗糖的THY液48h，蒸餾水洗滌后采用結(jié)晶紫染色并用熒光相差顯微鏡觀察生物膜形成情況；以乙醇：丙酮=8：2的洗滌液進(jìn)行洗脫附著染料并檢測其A575的吸光度值。
　?。?）利用傳統(tǒng)的KB法進(jìn)行藥敏實驗，比較各菌株的適應(yīng)性耐藥情況。
　?。?）在CSP誘導(dǎo)下，將穿梭質(zhì)粒pDL27

7、6分別轉(zhuǎn)化S. mutans UA159和△clpC缺陷株，觀察其感受態(tài)轉(zhuǎn)化率的影響。
　　（9）利用Trizol法分別抽提CSP誘導(dǎo)下各菌株的總RNA，Real-time PCR檢測感受態(tài)基因comX、cinA、comYA的表達(dá)情況。
　　結(jié)果：
　?。?）經(jīng)PCR、酶切及DNA測序證明，成功構(gòu)建同源重組載體pCKX3、pCKX4和變異鏈球菌無標(biāo)記SM-△clpP和SM-△clpC缺陷株。
　?。?）經(jīng)PCR和

8、測序證明，成功構(gòu)建補償質(zhì)粒pCKX5和補償菌株SclpP。
　?。?）37℃ CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)條件下，SM-△clpP的生長速度明顯低于野生株，補償菌株SclpP的生長速度介于野生株和SM-△clpP之間，但并未恢復(fù)到野生株的水平；而42℃ CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)條件下SM-△clpC的生長速度明顯高于野生株，SM-△clpP生長明顯低下。
　?。?）菌落數(shù)觀察，clpP缺陷株表現(xiàn)出對酸堿和氯化鈉的抵抗能力明顯下降；補償菌株的耐酸

9、堿鹽的能力恢復(fù)接近野生株水平。
　?。?）細(xì)菌在蔗糖培養(yǎng)液中的生物膜形成能力明顯強于葡萄糖培養(yǎng)液；在0.5%Glucose THY培養(yǎng)基中 clpP缺陷菌株的生物膜形成能力嚴(yán)重受損是野生株的42%；0.5%Sucrose THY培養(yǎng)基中clpP缺陷菌株的生物膜形成能力反而成倍增長是野生株的1.74倍；clpC基因基本不影響細(xì)菌生物膜的形成。
　?。?）與野生株相比，clpP缺陷株對抗生素的敏感性增加；clpC缺陷株的抗生素敏

10、感性無明顯變化。
　　（7） CSP誘導(dǎo)下，野生株的感受態(tài)轉(zhuǎn)化增長速率較快，50min～90min達(dá)到增長高峰；SM-△clpC于120min～150min時達(dá)到最高峰，并且延長中晚期感受態(tài)細(xì)胞的維持期。
　?。?）經(jīng)Real-time PCR檢測：與野生菌株相比，SM-△clpP菌株的晚期感受態(tài)基因comYA表達(dá)量上升2.007倍，而cinA、comX分別下降為73%和58.2%；SM-△clpC的感受態(tài)基因comYA、c