肺炎鏈球菌ClpE相互作用蛋白的篩選鑒定.pdf

1、目的
　　 HSP100/ClpATPase是一類高度保守而且廣泛存在的熱休克蛋白(heat shockprotein, HSP)，屬于AAA+(ATPase associated with diverse cellular activities)蛋白超家族，具有多種生物學(xué)功能。他們可以與蛋白酶ClpP結(jié)合形成ATP依賴的蛋白酶復(fù)合體促進特異的底物蛋白質(zhì)的水解，而ClpATPase決定了ClpP的裂解功能和降解底物的特異性[3]

2、。大量研究已證實ClpATPase在許多病原菌的致病過程中發(fā)揮了重要作用。在金黃色葡萄球菌，ClpX缺陷株的毒力顯著降低，這種作用主要是通過調(diào)節(jié)主要毒力因子的表達來實現(xiàn)的[8]。在單核細(xì)胞增多性李斯特菌，ClpC通過調(diào)節(jié)侵襲相關(guān)毒力因子的表達參與細(xì)菌粘附侵襲宿主細(xì)胞的過程[10]。
　　 我們課題組前期對肺炎鏈球菌ClpE的研究發(fā)現(xiàn):在小鼠腹腔感染模型clpE缺陷肺炎鏈球菌的致病能力明顯降低。那么ClpE影響細(xì)菌致病的機制如何呢

3、？即它是通過對哪些毒力因子的影響作用而調(diào)控細(xì)菌相應(yīng)的毒力表現(xiàn)呢？要想弄清這些問題，就必須尋找到與ClpE有相互作用的特異性蛋白底物。本研究擬通過目前應(yīng)用廣泛的研究蛋白質(zhì)相互作用的大腸桿菌雙雜交系統(tǒng)和免疫共沉淀實驗兩種方法來篩選ClpE的相互作用蛋白，進一步進行相應(yīng)的功能研究，初步揭示ClpE在肺炎鏈球菌中的作用機制。
　　 方法
　　 1.大腸桿菌雙雜交系統(tǒng)篩選首先，是ClpE蛋白的表達純化和多克隆抗體的制備。我們構(gòu)建了

4、含His標(biāo)簽的原核表達載體pET28a-ClpE，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)過夜表達后，采用鎳柱親和層析純化目的蛋白rClpE。進一步應(yīng)用SDS-PAGE對表達和純化產(chǎn)物進行分析后，透析除鹽。純化的rClpE抗原分別免疫BALB/c小鼠和新西蘭大白兔，制備rClpE多克隆抗體。
　　 其次，構(gòu)建誘餌質(zhì)粒pBT-ClpE，經(jīng)PCR和測序證明載體構(gòu)建成功后轉(zhuǎn)化大腸桿菌雙雜交系統(tǒng)菌株(編號200192)。IPTG誘

5、導(dǎo)后采用Western blot驗證ClpE的表達。同時共轉(zhuǎn)化pBT-ClpE和pTRG至大腸桿菌雙雜交系統(tǒng)菌株（編號200192），觀察在NSSM、SSM平板上的生長情況，對其自激活作用進行檢測，確定pBT-ClpE可以用于后續(xù)的篩選實驗。
　　 再次，構(gòu)建文庫質(zhì)粒pTRG-DNA片段。我們采用限制性內(nèi)切酶Sau3AⅠ隨機酶切肺炎鏈球菌基因組DNA后，與經(jīng)過BamHⅠ酶切的質(zhì)粒pTRG連接過夜，轉(zhuǎn)化大腸桿菌雙雜交系統(tǒng)菌株（編號

6、240065）。從而最終得到含有不同大小DNA片段的文庫混合質(zhì)粒。
　　 最后，誘餌質(zhì)粒pBT-ClpE和文庫混合質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化大腸桿菌雙雜交系統(tǒng)菌株(編號200190)，在選擇性平板SSM上篩選陽性克隆。
　　 2.免疫共沉淀篩選構(gòu)建含GFP標(biāo)簽的載體pAE03-ClpE，轉(zhuǎn)入肺炎鏈球菌D39，形成菌株D39(ClpE::GFP)。將GFP單克隆抗體，Protein G磁珠以及D39(ClpE:: GFP)裂解液或D39裂

7、解液（對照）在4℃孵育過夜后，與ClpE有相互作用蛋白可能已結(jié)合于protein G。磁珠經(jīng)過PBS洗5次后，SDS-PAGE檢測，兩組之間的差異條帶即為ClpE的相互作用蛋白。切膠后送深圳華大基因進行質(zhì)譜鑒定。
　　 3.ClpE對FtsW蛋白含量的影響研究在實驗中我們發(fā)現(xiàn)ClpE缺陷菌的細(xì)菌形態(tài)與野生菌相比存在差異，成長桿狀，無中間的凹陷。進一步電鏡觀察發(fā)現(xiàn)ClpE缺陷菌菌體要長于野生菌。推測ClpE可能參與調(diào)控細(xì)胞分裂。生

8、物信息學(xué)分析顯示，我們所篩選的ClpE相互作用蛋白FtsW與細(xì)胞分裂相關(guān)，因此我們對該蛋白進行了初步的功能研究:通過Westernblot觀察熱應(yīng)激對FtsW表達的影響，通過β-半乳糖苷酶活性檢測觀察ClpE在FtsW降解中的作用。
　　 結(jié)果
　　 1.成功構(gòu)建了ClpE原核表達載體pET28a-ClpE，獲得了純度大于85％的重組蛋白ClpE。純化的rClpE抗原分別免疫BALB/c小鼠和新西蘭大白兔，獲得了兔和鼠兩

9、種來源的rClpE多克隆抗體。
　　 2.Western blot證實誘餌質(zhì)粒pBT-ClpE可以正常表達，而且自激活實驗證實其無自主激活報告基因作用。通過大腸桿菌雙雜交系統(tǒng)的篩選，我們最終得到了25個陽性克隆。經(jīng)過PCR和測序鑒定，有2個DNA片段在pTRG載體上有正確表達，分別是細(xì)胞分裂蛋白FtsW和推測的組氨酸激酶SPD_2019。我們重新構(gòu)建了含有全長片段的pTRG-FtsW/SPD_2019載體，并通過雙雜交系統(tǒng)驗證他

10、們與ClpE具有相互作用。
　　 3.通過免疫共沉淀實驗的篩選，最終我們得到了6個ClpE相互作用蛋白，分別是丙酮酸氧化酶SpxB，氨肽酶PepN，1-乳酸脫氫酶Ldh，核糖體蛋白RpsD，磷酸烯醇丙酮酸蛋白磷酸轉(zhuǎn)移酶PtsI，氨甲?；?磷酸合成酶CarB。我們選擇其中與細(xì)菌毒力密切相關(guān)的SpxB和PepN進行了雙雜交系統(tǒng)的驗證，證明這兩個蛋白與ClpE具有相互作用。
　　 4.對FtsW蛋白的初步功能研究結(jié)果顯示，F(xiàn)t

11、sW在細(xì)菌處于熱應(yīng)激時表達增高。β-半乳糖苷酶活性測定顯示FtsW的降解在D39ΔclpE菌中要慢于野生菌。
　　 結(jié)論
　　 通過本研究共篩選到8個蛋白可能與ClpE具有相互作用，其中蛋白FtsW、SPD_2019、PepN和SpxB通過鑒定的確與ClpE具有相互作用，提示ClpE可能通過影響這些蛋白的含量影響細(xì)菌相關(guān)性質(zhì)及毒力;
　　 細(xì)胞分裂蛋白FtsW的表達受熱應(yīng)激誘導(dǎo)，而ClpE參與FtsW的降解，提示