ClpE在肺炎鏈球菌致病過程中的作用機(jī)制研究.pdf

1、肺炎鏈球菌（Streptococcus pneumoniae，S.pn）是一種常見的革蘭陽性條件致病菌，可引起肺炎、中耳炎、菌血癥、腦膜炎等嚴(yán)重疾病，在全球有很高的發(fā)病率和死亡率。老人、兒童、艾滋病和先天性免疫缺陷的患者是S.pn感染的高危人群。由于S.pn抗生素耐藥率的增加和目前疫苗的缺陷性，使得其防治面臨困境。要想從根本上解決S.pn的防治問題，就要深入了解其致病的分子機(jī)制，為研發(fā)新的藥物和疫苗提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 HSP

2、100/ ClpATPase是一類高度保守并廣泛存在的熱休克蛋白（heat shock protein，HSP），它除了具有分子伴侶的功能外，還與肽酶ClpP形成ATP依賴的蛋白酶復(fù)合物（如ClpAP，ClpBP等）特異性水解某些蛋白質(zhì)。研究顯示ClpATPase可影響某些基因的轉(zhuǎn)錄因子活性，從而調(diào)控包括毒力因子在內(nèi)的多種基因的表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)菌生長、毒力等多種生物學(xué)性狀發(fā)生改變。肺炎鏈球菌有四種ClpATPase（ClpC，ClpE，Cl

3、pL，ClpX）。已有的研究顯示ClpC、ClpL及ClpX都與S.pn的感染致病相關(guān)。但ClpE目前僅知道是肺炎鏈球菌溫度耐受的主要元件，對于其在肺炎鏈球菌致病過程中的作用尚不清楚。 本課題從整體水平、細(xì)胞水平和分子水平初步探索了ClpE在肺炎鏈球菌致病過程中的作用及機(jī)制，這可為深入了解肺炎鏈球菌致病機(jī)制提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。本課題包括以下兩個(gè)部分內(nèi)容： 1、構(gòu)建肺炎鏈球菌clpE缺失突變體，比較clpE缺陷菌株和野生菌

4、D39對小鼠的毒力差異，從總體水平上初步了解ClpE是否參與了肺炎鏈球菌的致病。 采用長臂同源多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Long flanking homology polymerase chain reaction，LFH-PCR）方法，制備中間為紅霉素耐藥基因（erm）兩側(cè)為clpE基因上、下游同源序列的連接片段，并將此片段轉(zhuǎn)化入肺炎鏈球菌D39，在含紅霉素的血平板上篩選出clpE缺陷菌株，并通過PCR、測序進(jìn)行鑒定；小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)比較

5、clpE缺陷菌株和野生菌D39對小鼠的毒力差異。PCR和測序結(jié)果顯示，我們構(gòu)建D39clpE缺陷菌株成功；小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，clpE缺陷菌株對小鼠的毒力較野生菌株明顯減低（P<0.01）。研究結(jié)果提示，ClpE可能在肺炎鏈球菌的致病過程中發(fā)揮了作用。 2、從細(xì)胞水平、分子水平進(jìn)一步了解ClpE在肺炎鏈球菌致病過程中的作用及其機(jī)制。 本研究觀察了不同溫度下clpE缺陷菌株和野生菌株在液體培養(yǎng)基中的生長情況；體外粘附、侵

6、襲實(shí)驗(yàn)比較缺陷菌株與野生菌株對宿主細(xì)胞（人肺腺癌細(xì)胞A549、人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC）的粘附、侵襲能力；熒光定量PCR檢測肺炎鏈球菌幾種主要毒力因子在缺陷菌株和野生菌株中的表達(dá)差異；雙向凝膠電泳比較缺陷菌株和野生菌株的蛋白表達(dá)差異，借助基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDI-TOF-MS）對部分蛋白質(zhì)分子進(jìn)行分析鑒定，并結(jié)合生物信息學(xué)方法尋找ClpE調(diào)節(jié)的蛋白質(zhì)分子。 結(jié)果顯示：1、在37℃時(shí)，clpE缺陷菌的生長繁殖

7、能力較野生菌株大大降低，而在40℃、42℃時(shí)，缺陷菌幾乎不能生長。2、clpE缺陷菌株對宿主細(xì)胞的粘附和侵襲能力都顯著弱于相應(yīng)的野生菌株（P<0.05）。3、同野生菌株比較，幾種重要毒力基因自溶素（major autolysin A，lytA）、表面粘附素A（pneumococcal surface adhesion A，psaA）、溶血素（pneumolysin，ply）、神經(jīng)酰胺酶（neuraminidase，nanA）和鏈球菌表面

8、蛋白A（pneumococcal surface protein A，pspA）在clpE缺陷菌中的表達(dá)量顯著下降（P<0.05）。4、與細(xì)菌生長、粘附侵襲、生物被膜形成密切相關(guān)的蛋白質(zhì)如次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（Hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase）、甲酸-四氫葉酸酯連接酶（Formate-tetrahydrofolate ligase）、吡咯烷羧酸肽酶（Pyrrolido

9、ne-carboxylate peptidase1）和雙功能蛋白PyrR（bifunctional protein PyrR）在缺陷菌中的表達(dá)量均明顯低于其野生菌。這些結(jié)果提示ClpE可能通過調(diào)控包括毒力因子在內(nèi)的一些蛋白質(zhì)的表達(dá)來影響肺炎鏈球菌的生存、對宿主細(xì)胞粘附、侵襲等多種生物學(xué)功能。 總之，本研究顯示ClpE可通過調(diào)控多種蛋白質(zhì)的表達(dá)來影響細(xì)菌的生存能力、對宿主細(xì)胞的粘附侵襲能力以及對宿主細(xì)胞的損傷能力，它是肺炎鏈球菌在