肺炎鏈球菌烯醇化酶與熱休克蛋白DnaJ相互作用研究.pdf

1、目的:
　　明確肺炎鏈球菌糖酵解關(guān)鍵酶烯醇化酶(enolase，Eno)與熱休克蛋白DnaJ是否有直接結(jié)合及結(jié)合位點(diǎn)，初步探討DnaJ蛋白對(duì)Eno蛋白胞內(nèi)蛋白水平及胞外分泌的影響。
　　方法:
　　原核表達(dá)并純化Eno全長蛋白，鑒定其酶活性，利用重組Eno蛋白皮下免疫昆明小鼠制備特異性抗血清，分析其蛋白表達(dá)及胞外分泌情況；采用生物膜層干涉(biolayer interferometrvy，BLI)技術(shù)和直接結(jié)合實(shí)驗(yàn)鑒定

2、Eno和DnaJ兩者之間是否存在直接相互作用；在前者結(jié)果陽性的基礎(chǔ)上，截短表達(dá)Eno蛋白，通過直接結(jié)合實(shí)驗(yàn)鑒定Eno蛋白結(jié)合DnaJ的位點(diǎn)。根據(jù)結(jié)合位點(diǎn)結(jié)果，構(gòu)建一系列異位表達(dá)的重組pJWv25-eno截短片段，轉(zhuǎn)化肺炎鏈球菌R6菌株，Western blot檢測(cè)各片段的胞內(nèi)及胞外蛋白水平，分析DnaJ的結(jié)合對(duì)Eno蛋白水平的影響。在肺炎鏈球菌中過表達(dá)DnaJ蛋白，通過Western blot檢測(cè)Eno蛋白的胞內(nèi)及胞外蛋白水平，進(jìn)一步鑒

3、定DnaJ對(duì)Eno蛋白胞內(nèi)蛋白水平及分泌的影響。
　　結(jié)果:
　　成功表達(dá)重組 Eno蛋白，純度達(dá)90％，該蛋白具有α-Eno酶活性；重組 Eno蛋白皮下免疫昆明小鼠后，獲得效價(jià)達(dá)1:7.68×106的特異性抗血清；Western blot分析顯示，7種不同血清型肺炎鏈球菌培養(yǎng)上清中均在分子量約47 kD處出現(xiàn)特異性反應(yīng)帶；直接結(jié)合試驗(yàn)顯示，隨著Eno蛋白量的增加，Eno與DnaJ的結(jié)合量也相應(yīng)增加(r=0.920，P=0.

4、000),其吸光度值從0.222±0.042(1.25μg)增加到0.569±0.099(20.0μg)；BLI技術(shù)測(cè)定兩者結(jié)合的親和常數(shù)為926 nmol/L；截短的Eno(aa1-aa100)與DnaJ的結(jié)合量2.25±0.38高于其他截短序列的結(jié)合量0.94±0.25、1.08±0.09、0.75±0.12，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000，P=0.001，P=0.000)。Western blot結(jié)果顯示，各截短片段均能在肺炎