無(wú)乳鏈球菌α-烯醇化酶原核表達(dá)及生物學(xué)特性研究.pdf

1、本試驗(yàn)以海南分離株羅非魚源無(wú)乳鏈球菌基因組DNA為模板，克隆并原核表達(dá)α-烯醇化酶蛋白，并應(yīng)用生物信息學(xué)對(duì)其氨基酸序列進(jìn)行分析。通過(guò)α-烯醇化酶活力，纖溶酶原綁定活力確定表達(dá)重組蛋白具有活性。探究α-烯醇化酶在無(wú)乳鏈球菌的定位和α-烯醇化酶粘附EPC細(xì)胞的性質(zhì)，初步確定其作為亞單位候選疫苗的可能性。用表達(dá)的重組蛋白作為抗原，進(jìn)行小鼠體內(nèi)免疫試驗(yàn)，探究其對(duì)小鼠的免疫保護(hù)率。通過(guò)本試驗(yàn)，擬對(duì)無(wú)乳鏈球菌α-烯醇化酶生物學(xué)特性有進(jìn)一步了解，并為

2、制備具有交叉保護(hù)力的抗無(wú)乳鏈球菌亞單位疫苗提供數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。
　　首先，對(duì)無(wú)乳鏈球菌α-烯醇化酶進(jìn)行克隆，成功獲得含陽(yáng)性質(zhì)粒pMD19-T-α-Eno的克隆載體。并利用生物信息學(xué)軟件對(duì)克隆的α-烯醇化酶的氨基酸序列進(jìn)行分析。結(jié)果顯示無(wú)乳鏈球菌α-烯醇化酶氨基酸序列含一個(gè)烯醇化酶樣結(jié)構(gòu)域，不含跨膜區(qū)，且沒有信號(hào)肽序列，是一個(gè)疏水蛋白。選取10種不同的致病鏈球菌以及4株無(wú)乳鏈球菌分離株的α-烯醇化酶氨基酸序列建立系統(tǒng)發(fā)育樹，發(fā)現(xiàn)在檢測(cè)的1

3、0種鏈球菌之間以及4株無(wú)乳鏈球菌分離株之間，α-烯醇化酶具有較高的同源性。對(duì)比無(wú)乳鏈球菌α-烯醇化酶氨基酸序列與海豚鏈球菌、肺炎鏈球菌以及化膿鏈球菌α-烯醇化酶氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)無(wú)乳鏈球菌α-烯醇化酶C端有決定纖溶酶原綁定的序列FYDAERKVY。
　　將含粘性末端的目的序列連接至表達(dá)質(zhì)粒pET32a(+)中，并轉(zhuǎn)化入表達(dá)載體BL21(DE3)，成功構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒，對(duì)目的蛋白進(jìn)行原核表達(dá)，并優(yōu)化表達(dá)條件。結(jié)果表明，無(wú)乳鏈球菌α-烯醇化

4、酶重組蛋白大小為67.2KDa最佳表達(dá)條件為37℃誘導(dǎo)表達(dá)3h，IPTG濃度為0.2mmol/L。利用表達(dá)質(zhì)粒中的組氨酸與咪唑的高親和力，親和層析純化目的蛋白，并用梯度尿素進(jìn)行復(fù)性，得到活性蛋白。
　　將制備的純化蛋白進(jìn)行生物學(xué)活性分析。純化后的蛋白具有烯醇化酶的活性，能將磷酸甘油酸轉(zhuǎn)化為磷酸烯醇式丙酮酸。蛋白質(zhì)免疫印跡檢測(cè)到重組α-烯醇化酶綁定人纖溶酶原的活力。兔抗α-烯醇化酶血清經(jīng)Western-blot和瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)檢測(cè)，重