牛乳腺炎無乳鏈球菌pgk基因抗原優(yōu)勢區(qū)序列的克隆與原核表達(dá).pdf

1、目的：構(gòu)建無乳鏈球菌pgk基因抗原優(yōu)勢區(qū)序列的重組原核表達(dá)載體,轉(zhuǎn)入大腸桿菌中表達(dá),并對其表達(dá)蛋白的反應(yīng)原性進(jìn)行鑒定。
　　 方法：提取無乳鏈球菌臨床分離菌株基因組DNA,根據(jù)GenBank公布的無乳鏈球菌pgk基因序列,應(yīng)用DNAStar軟件的Protean程序預(yù)測pgk基因抗原表位、親水性和抗原性指數(shù)等參數(shù),并設(shè)計引物,PCR擴(kuò)增出pgk基因抗原優(yōu)勢區(qū)序列。將其插入至表達(dá)質(zhì)粒pET-30(a)的多克隆位點(diǎn)(MCS),構(gòu)建重組

2、表達(dá)質(zhì)粒pgk—pET-30(a),將pgk—pET-30(a)轉(zhuǎn)入BL21(DE3),IPTG誘導(dǎo)表達(dá)并優(yōu)化誘導(dǎo)表達(dá)條件,應(yīng)用SDS—PAGE電泳分析表達(dá)蛋白圖譜。利用Western-blot驗(yàn)證重組表達(dá)蛋白的反應(yīng)原性,運(yùn)用Ni2+親和層析法在自然條件下純化并獲得重組蛋白。
　　 結(jié)果：經(jīng)測序和酶切分析結(jié)果表明,克隆獲得了無乳鏈球菌pgk基因抗原優(yōu)勢區(qū)序列,且插入片段讀碼框架正確,原核表達(dá)重組質(zhì)粒構(gòu)建正確。經(jīng)IPTG誘導(dǎo),pg

3、k-pET-30(a)/BL21(DE3)表達(dá)出相對分子質(zhì)量為35 KD的可溶性融合蛋白,表達(dá)量占菌體總蛋白量的43.8％。Western-blot結(jié)果表明重組蛋白具有良好的反應(yīng)原性,純化后蛋白含量為5.03mg/mL。
　　 結(jié)論：成功克隆牛乳腺炎無乳鏈球菌pgk基因抗原優(yōu)勢區(qū)序列,該序列長度為984bp,編碼328個氨基酸殘基,構(gòu)建的重組表達(dá)載體在大腸桿菌中獲得高效可溶性表達(dá),并驗(yàn)證了重組pgk蛋白的反應(yīng)原性,為奶牛乳腺炎的