魚(yú)源無(wú)乳鏈球菌bca基因的克隆、表達(dá)及亞單位疫苗和核酸疫苗的研究.pdf

1、無(wú)乳鏈球菌（Streptococcus agalactiae）是常見(jiàn)的人獸魚(yú)共患病原菌，自2007年以來(lái)，該菌每年都在我國(guó)廣東、海南、福建、廣西等羅非魚(yú)主要養(yǎng)殖區(qū)暴發(fā)流行，造成巨大經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重威脅著我國(guó)羅非魚(yú)產(chǎn)業(yè)鏈的健康發(fā)展。到目前為止，對(duì)羅非魚(yú)無(wú)乳鏈球菌病的治療效果欠佳，且未有可大面積推廣的有效疫苗。本研究以無(wú)乳鏈球菌C抗原α蛋白(編碼基因bca)為研究對(duì)象，通過(guò)對(duì)α蛋白的生物信息學(xué)分析，以bca基因N端保守區(qū)，分別構(gòu)建了亞單位疫苗

2、和核酸疫苗，并用構(gòu)建的疫苗免疫羅非魚(yú)，評(píng)估了疫苗的免疫效果。主要研究?jī)?nèi)容如下:
　　1.魚(yú)源無(wú)乳鏈球菌bca基因的克隆表達(dá)以及生物信息學(xué)分析
　　克隆了羅非魚(yú)源無(wú)乳鏈球菌HN0101分離株的bca基因，通過(guò)生物信息學(xué)軟件對(duì)其序列進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示:bca基因的ORF由1341個(gè)堿基組成，編碼一個(gè)長(zhǎng)度為446個(gè)氨基酸的多肽，N-端具有一個(gè)保守的YSIRK信號(hào)肽序列和一個(gè)AlphaC_N超家族結(jié)構(gòu)域，C-末端含有1個(gè)保守Gra

3、m_pos_anchor超家族結(jié)構(gòu)域，而在中間具有2個(gè)重復(fù)的Rib結(jié)構(gòu)域;比較不同來(lái)源分離株的α蛋白結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)主要區(qū)別在于Rib結(jié)構(gòu)域重復(fù)數(shù)目的不同;同源性及系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析，發(fā)現(xiàn)本株菌的α蛋白與已報(bào)道的人源A909和魚(yú)源GD201008-001α蛋白聚為一簇，同源性達(dá)100％;推測(cè)該蛋白為親水性蛋白，存在一個(gè)跨膜區(qū)，有37個(gè)潛在的磷酸化位點(diǎn)和1個(gè)潛在的N-糖基化位點(diǎn);二級(jí)結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)存在較多的無(wú)規(guī)則卷曲，推測(cè)有12個(gè)氨基酸區(qū)域可能是B細(xì)

4、胞抗原表位;當(dāng)選擇大腸桿菌BL21為表達(dá)宿主時(shí)，該重組蛋白的溶解度高達(dá)100％，亞細(xì)胞定位顯示該蛋白位于細(xì)胞壁上。
　　2.無(wú)乳鏈球菌pbca基因重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及免疫原性分析
　　根據(jù)對(duì)bca基因生物信息學(xué)分析結(jié)果，去掉跨膜區(qū)和革蘭氏陽(yáng)性菌錨定區(qū)域，選取表達(dá)部位51-401AA區(qū)間設(shè)計(jì)特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增片段經(jīng)膠回收后克隆至pMD19-T載體，鑒定正確后用BamHⅠ和XhoⅠ將目的片段從克隆質(zhì)粒上切出，并連接至

5、表達(dá)載體pET-32a(+)，得到重組表達(dá)質(zhì)粒pET-32a(+)-pbca;將重組表達(dá)質(zhì)粒經(jīng)鑒定正確后轉(zhuǎn)入BL21(DE3)，然后對(duì)重組表達(dá)宿主菌的誘導(dǎo)溫度、IPTG濃度和誘導(dǎo)時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化;在最優(yōu)條件下大量誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白，然后以純化的重組蛋白制備兔抗高免血清，用瓊擴(kuò)試驗(yàn)檢測(cè)抗體效價(jià)，并運(yùn)用western-blot檢測(cè)抗體與重組蛋白的免疫原性。結(jié)果顯示:最佳表達(dá)條件為溫度37℃，IPTG濃度為0.1mmol/L，誘導(dǎo)時(shí)間為4h;瓊脂糖

6、擴(kuò)散試驗(yàn)顯示制備的兔抗pBCA血清的抗體效價(jià)為1∶32;western-blot分析結(jié)果表明制備的血清能夠與重組蛋白進(jìn)行特異性結(jié)合。
　　3.無(wú)乳鏈球菌pbca基因重組亞單位疫苗對(duì)羅非魚(yú)免疫效果的研究
　　將制備的重組pBCA，分別以pBCA組、pBCA佐劑組和PBS對(duì)照組腹腔注射免疫健康羅非魚(yú)，分別在免疫后第7d、14d、21d、28d、35d、42d采集血清，用建立的ELISA方法檢測(cè)免疫抗體，結(jié)果顯示pBCA組和pBC

7、A佐劑組均能誘導(dǎo)魚(yú)體產(chǎn)生抗體，并且pBCA組在第四周抗體水平達(dá)到最高，pBCA佐劑組在第五周抗體水平達(dá)到最高。pBCA組和pBCA佐劑組與PBS對(duì)照組在第二周開(kāi)始，抗體水平差異極顯著(P＜0.01);溶菌酶活性分析發(fā)現(xiàn)，從免疫后第一周到第六周，pBCA組和pBCA佐劑組溶菌酶活力均極顯著高于PBS對(duì)照組(p＜0.01)，并且從第二周到第六周，pBCA組和pBCA佐劑組溶菌酶活力均維持較高水平，pBCA組在第四周達(dá)到最高峰，pBCA佐劑組

8、在第五周得到最高峰;對(duì)羅非魚(yú)的IL-1β和TNF-a基因在組織中轉(zhuǎn)錄分析發(fā)現(xiàn)，IL-1β和TNF-α基因在免疫組中，在脾臟和頭腎都有極顯著的轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)，且在脾臟中的轉(zhuǎn)錄水平高于在頭腎中的轉(zhuǎn)錄水平。攻毒試驗(yàn)結(jié)果顯示，pBCA佐劑組和pBCA組的相對(duì)保護(hù)率分別為66.67％和52.38％。以上結(jié)果表明重組pBCA具有較好的免疫保護(hù)作用，可以作為候選疫苗之一。
　　4.無(wú)乳鏈球菌pbca基因核酸疫苗的構(gòu)建
　　將pbca基因克隆

9、至真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)構(gòu)建了重組質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-pbca，然后通過(guò)菌落PCR以及雙酶切進(jìn)行pbca基因的鑒定。鑒定正確后，將構(gòu)建的真核重組質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-pbca的陽(yáng)性克隆分別接種于2L LB液體培養(yǎng)基中，擴(kuò)大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒。提取的重組質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-pbca經(jīng)電泳檢測(cè)，條帶大小約7200bp，與預(yù)計(jì)的大小一致，經(jīng)分析pcDNA3.1(+)-pbca濃度為1.4mg/L，0D268/28

10、0＞1.8，質(zhì)粒純度較高可以作為核酸疫苗使用。
　　5.無(wú)乳鏈球菌pbca基因核酸疫苗對(duì)羅非魚(yú)免疫效果的研究
　　將制備好的重組質(zhì)粒以肌肉注射的方式免疫羅非魚(yú)，分為DNA重組質(zhì)粒組、空質(zhì)粒組和PBS對(duì)照組，免疫后第7d、14d、21d采集肌肉組織，提取總RNA，RT-PCR擴(kuò)增以確定疫苗注射后目的基因表達(dá)情況。結(jié)果表明DNA重組質(zhì)粒疫苗組的三個(gè)時(shí)間點(diǎn)樣品均擴(kuò)增出目的基因，而空質(zhì)粒組和PBS對(duì)照組未擴(kuò)增出目的基因，證明重組表達(dá)

11、質(zhì)粒在魚(yú)體內(nèi)得到成功轉(zhuǎn)錄，構(gòu)建的核酸疫苗獲得成功。分別在免疫后第7d、14d、21d、28d、35d、42d采集血清，用建立的ELISA方法檢測(cè)免疫抗體，結(jié)果顯示重組質(zhì)粒能誘導(dǎo)魚(yú)體產(chǎn)生特異性抗體，到第四周時(shí)，抗體水平達(dá)到最高峰，第五周和第六周都維持較高水平。溶菌酶活性分析發(fā)現(xiàn)，從免疫后第一周到第六周，DNA疫苗組溶菌酶活力均極顯著高于PBS對(duì)照組(p＜0.01)，并且從第三周到第六周，DNA疫苗組溶菌酶活力均維持較高水平，在第五周達(dá)到最