牛源無乳鏈球菌sip基因編碼抗原表位序列的原核表達及其初步應(yīng)用研究.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、目的:構(gòu)建無乳鏈球菌sip基因編碼抗原表位序列的原核表達載體，在大腸桿菌中表達，并對其表達蛋白的免疫學活性及其應(yīng)用進行研究。
　　 方法:提取無乳鏈球菌臨床分離菌株基因組DNA，根據(jù)GenBank公布的無乳鏈球菌sip基因序列，應(yīng)用DNAStar軟件Protean程序預測sip基因抗原表位、親水性和抗原性指數(shù)等參數(shù)，并設(shè)計引物，PCR擴增出sip抗原表位基因。將其插入至表達質(zhì)粒pET-30(a)的多克隆位點(MCS)，構(gòu)建重組表

2、達質(zhì)粒sip-pET，以常規(guī)轉(zhuǎn)化方法將sip-pET轉(zhuǎn)入E.coli/BL21(DE3)，IPTG誘導表達并優(yōu)化誘導表達條件，應(yīng)用SDS-PAGE電泳分析表達蛋白圖譜，Western-blot技術(shù)驗證重組蛋白的免疫活性。運用Ni2+親和層析法在自然條件下純化重組蛋白，并建立間接ELISA方法，應(yīng)用該方法對無乳鏈球菌全菌體裂解免疫制劑免疫的家兔血清抗體滴度進行檢測。
　　 結(jié)果:結(jié)果經(jīng)測序和酶切分析表明，克隆獲得了無乳鏈球菌sip

3、抗原表位編碼序列，且插入片段讀碼框架正確，原核表達重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。經(jīng)IPTG誘導，BL21(DE3)/sip-pET系統(tǒng)表達出相對分子質(zhì)量為40 KD的可溶性融合蛋白(表達量占菌體總量的43.8％)。Western-blot證實了重組蛋白的免疫活性。純化后蛋白含量為5.09mg/ml，間接ELISA方法檢測3次免疫后58 d的血清免疫組抗體滴度達到1∶3200，免疫70 d后仍保持較高抗體滴度。
　　 結(jié)論:成功克隆牛源無乳鏈

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