Sip蛋白高親和性噬菌體介導(dǎo)的牛源無乳鏈球菌間接ELISA方法的建立.pdf

1、奶牛乳腺炎是奶牛最常見的疾病之一，影響奶牛的產(chǎn)奶量和牛奶品質(zhì)，嚴(yán)重的可導(dǎo)致奶牛泌乳功能喪失甚至被迫淘汰，大大降低奶牛養(yǎng)殖的經(jīng)濟(jì)效益，給養(yǎng)牛業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。同時病原微生物可通過污染的奶制品而感染人，對人類健康造成危害。無乳鏈球菌是奶牛乳腺炎的主要病原之一，無乳鏈球菌感染雖不引起乳房明顯的膿腫或纖維化，但是可以導(dǎo)致腺體感染，造成產(chǎn)奶量持續(xù)減少。其表面免疫相關(guān)蛋白(Sip)暴露在細(xì)菌的表面，在多種血清型的無乳鏈球菌菌株中均有表達(dá)，是細(xì)菌

2、重要的黏附和定植因子之一，具有較好的免疫保護(hù)作用和良好的抗原性，是無乳鏈球菌重要的候選疫苗抗原之一。九種不同血清型菌株Sip蛋白氨基酸序列比較結(jié)果顯示此蛋白質(zhì)高度保守。因此，利用此蛋白開發(fā)一個迅速有效的檢測方法監(jiān)控?zé)o乳鏈球菌感染，提高乳制品的質(zhì)量和安全，具有重要的應(yīng)用價值。
　　本研究參照GenBank公布的牛源無乳鏈球菌Sip基因序列(AF151361)設(shè)計一對特異性引物，成功構(gòu)建pGEX-6p-1-Sip原核表達(dá)質(zhì)粒。經(jīng)IPT

3、G誘導(dǎo)表達(dá)及條件優(yōu)化，成功在大腸桿菌感受態(tài)Rosetta(DE)中表達(dá)了分子量為59.8 Ku的無乳鏈球菌Sip重組蛋白，其優(yōu)化條件為終濃度1.0 mmol/L IPTG37℃恒溫誘導(dǎo)5h。純化的重組蛋白為其后噬菌體的篩選提供了材料。
　　隨后，以純化的無乳鏈球菌Sip重組蛋白為靶分子，用M13噬菌體cDNA文庫，進(jìn)行4輪噬菌體生物淘選。無乳鏈球菌Sip蛋白的首輪包被量為10μg/孔，此后每輪依次減半，噬菌體每輪投入量均為1.5×

4、1011 CFU/μL。經(jīng)過噬菌體淘洗、擴(kuò)增和滴度測定，最終在總數(shù)少于100的LB/IPTG/Xgal平板上隨機(jī)挑取10個噬菌體藍(lán)斑于搖菌管中進(jìn)行4.5 h擴(kuò)增后測定其滴度。擴(kuò)增后的10個噬菌體分別進(jìn)行噬菌體與靶分子的噬菌體ELISA親和能力的測試，檢測結(jié)果顯示，所獲取的10個隨機(jī)噬菌體均與靶分子具有高度的親和能力，為ELISA方法檢測無乳鏈球菌的建立奠定了基礎(chǔ)。
　　利用能與無乳鏈球菌Sip蛋白結(jié)合的噬菌體作為第一抗體，M13多

5、抗作為第二抗體，建立了可快速檢測含無乳鏈球菌奶樣的間接ELISA檢測方法并進(jìn)行了條件優(yōu)化。優(yōu)化結(jié)果為:抗原包被濃度（即敏感度）為10 CFU/mL/孔，噬菌體最佳作用濃度為108 PFU/mL;抗原最佳包被方式確定為37℃包被2h時后4℃過夜的方式;最佳封閉劑的選擇為1.0％BSA磷酸鹽緩沖液置37℃封閉3 h;噬菌體最佳孵育時間為60 min; M13多抗1∶1000倍稀釋孵育45 min;酶標(biāo)抗體最佳稀釋度為1∶4000，最佳孵育時