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文檔簡介
1、 馬鏈球菌獸疫亞種(SEZ)和豬鏈球菌2型(SS2)是我國豬鏈球菌病的兩種主要病原。SEZ主要引起豬的化膿性關(guān)節(jié)炎和敗血癥,而SS2不僅可引起豬腦膜炎、關(guān)節(jié)炎、心內(nèi)膜炎、敗血癥、肺炎和突然死亡,還可以感染相關(guān)人員并致死,是一種重要的人畜共患病病原。 SS2在世界很多國家均受到重視,對(duì)它的研究主要集中在與毒力相關(guān)蛋白的研究上。溶菌酶釋放蛋白(MRP)和胞外蛋白因子(EPF)是SS2兩個(gè)主要的致病因子?! ”緦?shí)驗(yàn)?zāi)康氖峭ㄟ^DNASt
2、ar軟件分析,克隆表達(dá)mrp和epf一段基因,驗(yàn)證該片段具有免疫原性后,通過PCR串聯(lián)兩片段并克隆表達(dá),通過動(dòng)物保護(hù)性試驗(yàn)明確串聯(lián)表達(dá)的蛋白是否具有更好的保護(hù)作用,為進(jìn)一步研究其結(jié)構(gòu)和協(xié)同作用機(jī)理、研制亞單位疫苗提供依據(jù)?!?本實(shí)驗(yàn)對(duì)三種抗原進(jìn)行篩選,優(yōu)化條件,建立檢測(cè)兩種豬源鏈球菌抗體的間接ELISA方法,并對(duì)豬免疫鏈球菌2價(jià)滅活苗后的抗體進(jìn)行檢測(cè),找出抗體消長規(guī)律;每隔一定時(shí)間,分別以最小致死量強(qiáng)毒株CY與SS2-1對(duì)豬進(jìn)行攻毒
3、,探討CPS抗體水平與免疫保護(hù)之間的關(guān)系。并運(yùn)用此方法對(duì)周邊豬場(chǎng)的臨床血清樣品進(jìn)行了檢測(cè)。 1.豬鏈球菌2型MRP和EPF基因片段的克隆與串聯(lián)表達(dá) 按照GenBank中的mrp、epf基因序列,利用DNAStar軟件分析,選取一段基因序列,各設(shè)計(jì)一對(duì)引物,兩端分別加限制性酶的酶切位點(diǎn)NcoⅠ、EcoRⅠ和EcoRⅠ、XhoⅠ,分別構(gòu)建原核表達(dá)載體pET32a-mrp、pET32a-epf,經(jīng)克隆表達(dá)得到分子量為43kD、47
4、kD的重組蛋白,免疫印跡表明該片段是MRP、EPF的重要功能區(qū),具有MRP、EPF的中和表位。 2.重組蛋白的免疫保護(hù)試驗(yàn)與兩毒力因子的協(xié)同作用機(jī)理 利用重組蛋白含有的6個(gè)組氨酸殘基與Ni2+結(jié)合的特性,用Ni-NTAHis·BindResin純化,得到單一條帶的串聯(lián)表達(dá)蛋白。將融合蛋白MRP-EPF用弗氏佐劑乳化后免疫兔,同時(shí)以MRP、EPF、全菌苗SS2-1作平行實(shí)驗(yàn)?! ∵x用SEZ和SS2的全菌(WAC)、超聲波抗原
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