肺炎鏈球菌非經典分泌蛋白GAPDH的分泌機制及其與熱休克蛋白DnaJ的相互作用研究.pdf

1、目的：明確肺炎鏈球菌非經典分泌蛋白GAPDH的分泌是否由細菌裂解引起，并確定 GAPDH分泌必需結構域。同時，驗證該蛋白與熱休克蛋白的DnaJ的相互作用，為深入研究GAPDH的分泌機制奠定基礎。
　　方法：原核表達GAPDH重組蛋白并制備其多克隆抗體，利用該多克隆抗體通過Western Blot評價GAPDH在肺炎鏈球菌中的保守性。缺失肺炎鏈球菌主要自溶酶 LytA使其喪失自溶能力，通過 Western Blot比較野生菌和Lyt

2、A缺陷菌GAPDH的分泌是否存在差異。同時以只在細胞內表達的CodY蛋白為參照，鑒定肺炎鏈球菌對數生長早期GAPDH的分泌是否伴有細菌裂解。利用Jpred3軟件分析GAPDH二級結構和功能結構域，利用Swiss-Model軟件對GAPDH進行同源模建，根據生物信息學結果進行截短表達設計。利用分子克隆技術將不同GAPDH截短表達基因片段克隆到異位表達載體pJW-v25質粒，經測序鑒定后將重組質粒轉化肺炎鏈球菌D39，采用0.15mm Zn

3、2+誘導表達含有GFP標簽的GAPDH。分離亞組份，采用Western Blot檢測截短表達的GAPDH在肺炎鏈球菌的定位，初步確定分泌必需結構域。采用結構替代和氨基酸突變兩種方法進一步驗證分泌必需結構域在GAPDH分泌中的作用，并確定參與GAPDH分泌的關鍵性氨基酸。將肺炎鏈球菌 GAPDH分泌必需結構域和枯草芽孢桿菌168菌株的GAPDH同源序列進行替換，評價該分泌必需結構域是否具有普遍性。在肺炎鏈球菌中，將GAPDH的結構域I進行

4、直接連接或柔性結構連接后，與GFP標簽蛋白融合表達，觀察融合蛋白的分泌及表面定位情況，以確定結構域I能否作為一個信號肽介導蛋白質的分泌。在肺炎鏈球菌中異位表達枯草芽孢桿菌168菌株 GAPDH，觀察其分泌情況，探討GAPDH在肺炎鏈球菌和枯草芽孢桿菌中是否具有共同的分泌途徑。采用大腸桿菌雙雜交系統(tǒng)、直接結合實驗、生物膜干涉技術驗證GAPDH和熱休克蛋白DnaJ的相互作用，并初步探討DnaJ對GADPH分泌的影響。
　　結果：獲得了

5、純度達90％的GAPDH重組蛋白，并制備了效價達107的抗GAPDH多克隆抗體。Western blot結果顯示，在對數生長早期二型肺炎鏈球菌莢膜型D39和莢膜缺陷型R6細胞壁及培養(yǎng)上清中均檢測到GAPDH的表達，但是并沒有檢測到CodY的表達。同時，主要自溶酶 LytA缺失后，培養(yǎng)上清依舊檢測到 GAPDH的表達，與野生菌相比無明顯差異。提示，肺炎鏈球菌GAPDH的分泌不是由于細菌自溶引起。用Jpred3軟件分析發(fā)現，GAPDH具有兩

6、個結構域：結構域I和II。結構域I由N末端的1-150aa和C末端α螺旋（317-335aa）構成。結構域II由151-316aa構成。對GAPDH進行同源建模，也發(fā)現GAPDH N末端和C末端在空間上相互靠近構成結構域I。根據以上生物信息學結果我們設計了GAPDH截短表達。Western blot結果顯示，結構域I的 N末端1-30aa和（或） C末端α螺旋缺失后， GAPDH都不能定位于細菌表面及分泌到培養(yǎng)上清，提示結構域 I是GA

7、PDH在細胞表面定為及分泌的必需結構域。氨基酸突變結果顯示， N末端的氨基酸3VKVGIN9、18GGG20和C末端325RTLEYF330突變后GAPDH的表面定位和胞外分泌都缺失，提示這些氨基酸是 GAPDH的表面定位和分泌的關鍵氨基酸。此外10F突變后，GAPDH在上清中消失，但仍出現于細胞表面，提示該突變只影響了GAPDH在上清的分泌，并不影響 GAPDH在細胞表面的定位；而322QLV324突變后， GAPDH不能定位到細胞表

8、面，但是可以分泌到培養(yǎng)上清，提示該突變只影響了GAPDH在細胞表面的定位，并不影響GAPDH在上清的分泌。單獨的結構域I與GFP融合后，其只表達于胞內，上清中沒有檢測到融合蛋白，柔性結構連接的結構域I也不能分泌到胞外，提示單獨的結構域 I不能介導蛋白質的分泌?？莶菅挎邨U菌168菌株GAPDH在肺炎鏈球菌中能夠表達，但在細胞表面和上清中均檢測不到該蛋白，提示其在肺炎鏈球菌中不能定位到細胞表面及分泌到胞外，表明GAPDH在枯草芽孢桿菌和肺炎

9、鏈球菌中的分泌途徑存在差異。大腸桿菌雙雜交、ELISA直接結合實驗和BLI生物膜干涉技術結果顯示GAPDH和熱休克蛋白DnaJ具有直接的相互作用。
　　結論：肺炎鏈球菌GAPDH的分泌并不是細菌自身裂解引起的，結構域I的是其表面定位及分泌所必需的，但不足以使蛋白分泌到胞外。N末端氨基酸3VKVGIN9、18GGG20和C末端325RTLEYF330是GAPDH的表面定位和分泌的關鍵氨基酸。肺炎鏈球菌和枯草芽孢桿菌中的GAPDH分泌