家蠶腸道短小芽孢桿菌SW41脂肪酶基因的克隆、表達(dá)及酶活性分析.pdf

1、家蠶是一類重要的經(jīng)濟(jì)資源昆蟲，在國(guó)民經(jīng)濟(jì)中占有重要地位，而蠶病的發(fā)生一直困擾著蠶桑業(yè)的發(fā)展，尤其是家蠶核型多角體病毒病(BmNPV)，它是蠶業(yè)生產(chǎn)中危害最為嚴(yán)重的一種病毒病。家蠶在長(zhǎng)期的進(jìn)化過程中，逐漸形成了一些自我保護(hù)的免疫防御機(jī)制。日本學(xué)者發(fā)現(xiàn)家蠶中腸分泌的脂肪酶對(duì)BmNPV具有強(qiáng)的抑制作用，國(guó)內(nèi)一些學(xué)者克隆了家蠶腸道脂肪酶基因，發(fā)現(xiàn)其表達(dá)產(chǎn)物對(duì)BmNPV也有抑制作用。本研究室向蕓慶等發(fā)現(xiàn)桑葉飼養(yǎng)蠶腸道菌種類比柘葉飼養(yǎng)蠶豐富，其腸道

2、產(chǎn)生的優(yōu)勢(shì)菌也更為豐富;謝洪霞、薛英偉、王曉強(qiáng)等發(fā)現(xiàn)柘葉飼養(yǎng)蠶易感染BmNPV，且柘葉飼養(yǎng)蠶體內(nèi)大部分抗BmNPV相關(guān)蛋白酶及家蠶抗逆性酶活性均有不同程度的下降;馮偉等從家蠶腸道優(yōu)勢(shì)菌中分離鑒定了9種產(chǎn)脂肪酶的細(xì)菌。綜上，我們推測(cè)產(chǎn)脂肪酶的菌種可能與家蠶抗BmNPV有關(guān)。本研究旨在探討家蠶腸道優(yōu)勢(shì)菌所產(chǎn)脂肪酶與BmNPV的關(guān)系，期望在家蠶新型飼料及抗病育種方面提供新的思路。
　　本實(shí)驗(yàn)以來源于家蠶腸道的短小芽孢桿菌SW41菌株為試

3、驗(yàn)材料，利用分子生物學(xué)相關(guān)技術(shù)，克隆了短小芽孢桿菌SW41的脂肪酶基因Lipase，與細(xì)菌其他種屬的脂肪酶基因進(jìn)行了比較分析，并將該基因連接到pColdⅠ表達(dá)載體上，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21(DE3)中，進(jìn)行了原核表達(dá)及其活性的檢測(cè)。主要研究?jī)?nèi)容和結(jié)果如下:
　　1.Lipase基因的克隆及生物信息學(xué)分析
　　提取短小芽孢桿菌SW41菌株的基因組DNA，設(shè)計(jì)引物，PCR擴(kuò)增獲得脂肪酶基因Lipase的完整ORF，大小為648b

4、p，共編碼215個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)Lipase蛋白理論分子量為22.95kDa，等電點(diǎn)為9.92;在線預(yù)測(cè)其信號(hào)肽、跨膜域及N糖基化位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)Lipase蛋白N端前34個(gè)氨基酸含有它的信號(hào)肽序列，它沒有跨膜域，且不存在N糖基化位點(diǎn)，因此Lipase蛋白為分泌型蛋白，非糖蛋白;二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)其符合脂肪酶所特有的α/β折疊結(jié)構(gòu);結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)Lipase蛋白屬于α/β水解酶家族，并具有脂肪酶家族的保守序列。親緣關(guān)系分析表明，家蠶腸道菌短小芽孢

5、桿菌SW41的脂肪酶可能具有抑制BmNPV的潛力。
　　2.Lipase基因的原核表達(dá)及Western鑒定
　　將Lipase基因ORF全長(zhǎng)片段連接到線性化的pColdⅠ表達(dá)載體上，經(jīng)菌液PCR和質(zhì)粒雙酶切鑒定獲得了pColdⅠ-Lipase原核重組表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21(DE3)中，在15℃，100rpm，1 mM IPTG的條件下誘導(dǎo)24 h，SDS-PAGE檢測(cè)發(fā)現(xiàn)該蛋白以可溶、包涵體及分泌性三種形式表達(dá)。利

6、用western blotting方法鑒定該蛋白，確定該蛋白為目的蛋白脂肪酶。
　　3.重組脂肪酶活性的檢測(cè)
　　采用羅丹明B平板法初步檢測(cè)重組脂肪酶活性，采用對(duì)硝基苯芬法測(cè)定重組脂肪酶活力。羅丹明B平板法結(jié)果顯示:涂布有重組脂肪酶粗酶液的培養(yǎng)基上長(zhǎng)出了單菌落，對(duì)照組均無菌落長(zhǎng)出;紫外光激發(fā)下發(fā)現(xiàn)菌落顯示出橘黃色的熒光，說明脂肪酶的存在并具有一定的活性;對(duì)硝基苯芬法測(cè)定結(jié)果顯示:粗酶液中重組脂肪酶的酶活力為14.72 U/m