解淀粉芽孢桿菌SWB16脂肪酶基因的克隆、表達(dá)及活性檢測(cè).pdf

1、家蠶是一種鱗翅目模式昆蟲(chóng)，也作為經(jīng)濟(jì)性昆蟲(chóng)為養(yǎng)蠶業(yè)帶來(lái)了豐厚的收入。但是蠶病的發(fā)生嚴(yán)重制約了蠶桑業(yè)的發(fā)展，特別是家蠶核型多角體病毒（Bombyx mori nucleopolyhedrovirus，BmNPV）感染導(dǎo)致的血液型膿病，是生產(chǎn)中危害最嚴(yán)重的一類(lèi)病毒病。家蠶在自然進(jìn)化中發(fā)展出物理阻隔、體液免疫和細(xì)胞免疫三道防線來(lái)抵抗病原體的侵染。家蠶脂肪酶作為家蠶腸道中的抗病毒蛋白，在家蠶對(duì)BmNPV體液免疫中發(fā)揮作用已最先被日本研究人員證實(shí)

2、。國(guó)內(nèi)學(xué)者發(fā)現(xiàn)野蠶腸道脂肪酶同樣具有抗BmNPV活性，并在體外純化獲得了有抗BmNPV活性的野蠶脂肪酶。此外，有研究團(tuán)隊(duì)還建立了增量表達(dá) Bmlipase-1的轉(zhuǎn)基因家蠶品系，有效提高了家蠶對(duì) BmNPV的抵抗力。本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)家蠶分別以桑葉和柘葉飼養(yǎng)時(shí)，其抗BmNPV的能力顯著不同，其中柘葉飼養(yǎng)會(huì)降低家蠶對(duì)BmNPV的抵抗力。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，柘葉飼養(yǎng)蠶腸道內(nèi)的微生態(tài)優(yōu)勢(shì)菌群組成類(lèi)型與桑葉飼養(yǎng)蠶差別較大，且優(yōu)勢(shì)菌群豐度降低；腸道內(nèi)

3、脂肪酶產(chǎn)生菌的種類(lèi)也明顯不如桑葉飼養(yǎng)蠶腸道中的脂肪酶產(chǎn)生菌豐富；消化液中的脂肪酶、胰蛋白酶等抗病毒蛋白的活性亦低于桑葉飼養(yǎng)蠶。上述研究暗示，家蠶腸道菌產(chǎn)生的脂肪酶也可能參與了家蠶對(duì)BmNPV的免疫活動(dòng)，甚至外源微生物所產(chǎn)脂肪酶也可能有此功效。為獲得大量高純度微生物源脂肪酶，本實(shí)驗(yàn)選擇產(chǎn)脂肪酶的藥用植物內(nèi)生菌解淀粉芽孢桿菌Bacillus amyloliquefaciens SWB16為研究對(duì)象，克隆、原核表達(dá)其脂肪酶，采用Ni-NTA法

4、進(jìn)行純化，并檢測(cè)其活性及含量，為后續(xù)研究奠定了基礎(chǔ)。
　　本研究主要內(nèi)容包括：⑴以SWB16 DNA為模板，利用引物L(fēng)IP-F和LIP-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，成功克隆出SWB16 Lipase基因，其完整ORF長(zhǎng)645bp，共編碼214個(gè)氨基酸。根據(jù)預(yù)測(cè)，該脂肪酶理論分子量為22.73 kDa，等電點(diǎn)為9.82，屬于堿性蛋白。SWB16脂肪酶的N端有2個(gè)跨膜域，其中第7到第29位氨基酸為第一個(gè)跨膜域，第39到第61位氨基酸為第二個(gè)跨膜

5、域，但不存在 N糖基化位點(diǎn)。進(jìn)一步分析其二級(jí)結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)SWB16脂肪酶具有大量無(wú)規(guī)則卷曲和延伸片段及少量的α螺旋、β折疊結(jié)構(gòu)，其中第33-134個(gè)氨基酸之間為該蛋白的功能結(jié)構(gòu)域。通過(guò)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)分析該脂肪酶的功能結(jié)構(gòu)域，發(fā)現(xiàn)第36-180位氨基酸屬于脂肪酶家族 Lipase-2，并且在39-138個(gè)氨基酸之間存在α/β水解酶家族的保守序列，說(shuō)明SWB16脂肪酶蛋白屬于α/β水解酶家族，具有脂肪酶的特有結(jié)構(gòu)和功能。⑵采用pET28a

6、表達(dá)載體進(jìn)行Lipase基因的亞克隆，成功構(gòu)建pET28-lipase重組表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化E.coli BL21（DE3）后進(jìn)行原核誘導(dǎo)表達(dá)，最佳誘導(dǎo)條件是20 ℃，100 r/min，0.1mmol/L IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)12h。SDS-PAGE檢測(cè)發(fā)現(xiàn)目的蛋白在37 ℃、28 ℃和20 ℃時(shí)均主要以包涵體形式表達(dá)，也能夠可溶表達(dá)。⑶利用Ni-NTA親和層析分離表達(dá)的HIS-LIPASE融合蛋白，經(jīng)超濾濃縮獲得純化的脂肪酶。通過(guò)羅丹明 B