嗜熱真菌脂肪酶基因的克隆、表達(dá)及定向進(jìn)化.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、易錯PCR方法，建立了含有9654個轉(zhuǎn)化子的突變體庫。通過三丁酸甘油酯平板透明圈法、小量發(fā)酵和大量發(fā)酵法篩選突變體庫。最終獲得9個突變菌株，經(jīng)發(fā)酵酶活測定發(fā)現(xiàn)酶活最高提高到原始菌株的1.24倍，沒有達(dá)到預(yù)期的效果。同時利用易錯PCR方法對疏綿狀嗜熱絲孢菌（Thermomyces lanuginosus）脂肪酶LN進(jìn)行定向進(jìn)化。采用易錯PCR方法，建立了含有11736個轉(zhuǎn)化子的突變體庫。通過篩選，最終獲得2株酶活力分別是野生菌酶活力3.4

2、倍和2.2倍的突變體菌株:GS-LN4和GS-LN11。對突變體菌株測序并與野生菌株基因比較發(fā)現(xiàn)，GS-LN4中有4個堿基發(fā)生改變，其中2個位點(diǎn)引起氨基酸變化，它們是A96V，Q132R;GS-LN11中基有7個堿基發(fā)生變化，其中引起7個氨基酸變化，分別是E16D，D50V，L98F，R130K，F(xiàn)147Y，N231D，T236S。對這兩個工程菌株進(jìn)行發(fā)酵，通過硫酸銨沉淀、DEAE-Sepharose陰離子交換柱層析等步驟，得到了純化的

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