深海嗜冷桿菌低溫脂肪酶基因的克隆表達、酶的純化及性質(zhì)研究.pdf

1、脂肪酶（lipases，E.C.3.1.1.3），全稱為三酰甘油酰基水解酶(triacylglycerolacylhydrolase)，屬于α/β折疊酶家族，是一類絲氨酸水解酶。它們在非水介質(zhì)中有較高的活力和穩(wěn)定性，所以可以用來催化有機反應(yīng)，如酯化和轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)。由于低溫脂肪酶在低溫條件下（0℃～30℃）具有良好的催化特性，Kcat值和生理效率（Kcat/Km）高，活化能低，具有反應(yīng)條件溫和、副產(chǎn)物少，可以節(jié)約能源保護環(huán)境，因此廣泛用于工

2、業(yè)生產(chǎn)，也因此成為國內(nèi)外酶學研究的熱點。
　　 本研究從實驗室保存的80株篩選于沖繩海槽的菌株中，用三丁酸甘油酯和Tween80篩選出1株產(chǎn)低溫脂肪酶的菌株，經(jīng)16SrRNA基因序列分析鑒定為嗜冷桿菌，并定名為Psychrobactersp.C18。
　　 考慮到此菌株的低溫難培養(yǎng)和產(chǎn)酶量低的缺點，我們對低溫脂肪酶基因進行了中溫宿主的克隆與表達研究。采用限制性內(nèi)切酶Sau3A(Ⅰ)酶切基因組DNA，回收2～7kb的DNA

3、片段，然后與事先經(jīng)BamH(Ⅰ)酶切且去磷酸化的質(zhì)粒載體pUC19連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，以此建立基因組DNA文庫，采用三丁酸甘油酯平板和藍白斑篩選相結(jié)合的方法從基因文庫中篩選到2株陽性克隆命名為pL1和pL2，測序分析表明為同一克隆。該核苷酸序列包含有完整的閱讀框，共945bp，編碼315個氨基酸，預(yù)測其分子量為35，028Da，將此序列提交GenBank，得到登陸號為:GU583649，并定義此脂肪酶基因為lipX.該酶包含大多

4、數(shù)脂肪酶都存在的以Ser為中心的保守序列GNSMG(GxSxG,x為任意堿基)，和保守域HG。以lipX的開放閱讀框設(shè)計引物，使其C-末端帶有His-tag，并去掉N端信號肽序列，PCR產(chǎn)物酶切后轉(zhuǎn)化已酶切后的pET-28a(+)構(gòu)建表達載體pET28a(+)/lipXHis，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)。優(yōu)化表達條件，其最佳表達條件是:37℃培養(yǎng)至OD600nm值為0.6時加入終濃度為0.1mM的IPTG，20℃誘導表達8h。用鎳柱

5、親和層析純化脂肪酶，最后純化倍數(shù)為10.7，產(chǎn)量達59.1％,最終得到酶活為623.3U/mg的純酶。研究其酶學性質(zhì)發(fā)現(xiàn)，該脂肪酶的最適作用溫度為30℃，并且在小于30℃的溫度范圍內(nèi)穩(wěn)定，40℃還保持80％的活力;其最適作用pH為8.0，因此屬于堿性低溫脂肪酶;Ca2+，Mg2+，K+，Cu2+對酶有激活作用而Zn2+，Co2+，Mn2+,Fe3+都對酶活有抑制作用，其中Zn2+對脂肪酶活性的抑制作用最大;一定濃度的鹽度對脂肪酶有顯著激