南極大磷蝦脂肪酶提取純化及其酶學(xué)性質(zhì)研究.pdf

1、南極大磷蝦是一類廣泛分布于南極海域的多年生浮游甲殼動物,具有生物量大、分布廣、營養(yǎng)價值高等特點,是重要的海洋蛋白新資源,同時,因其生活環(huán)境和方式的特殊性而具有產(chǎn)生新型生物活性物質(zhì)的巨大潛力,因其潛在的漁業(yè)價值而日益受到重視。南極大磷蝦生物活性物質(zhì)包括酶、脂質(zhì)、甲殼素、生物活性肽和紫外吸收物質(zhì)等。在其體內(nèi)具有非常高效的消化系統(tǒng),當(dāng)磷蝦死后,消化酶迅速將磷蝦的蛋白質(zhì)、多糖等降解,這種高效的消化酶活性引起了人們的興趣,現(xiàn)在已經(jīng)對部分酶進行了純

2、化和性質(zhì)研究工作。與此相對的,對其脂肪酶的研究工作尚未展開。而脂肪酶作為一種重要的工業(yè)用酶,在食品、化工、紙漿、飼料工業(yè)等領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。其中,低溫脂肪酶主要適用于如食品領(lǐng)域,醫(yī)藥,環(huán)保等。低溫脂肪酶在低溫下仍保持高酶活,因此在應(yīng)用中有著中溫脂肪酶無法取代的優(yōu)越性,而具有高活性的低溫脂肪酶因其具有理論和應(yīng)用上的雙重意義成為了近年來的研究熱點。因此,對南極大磷蝦脂肪酶進行分離純化,酶學(xué)性質(zhì)探索和生物學(xué)活性研究,具有一定的理論和應(yīng)用價值。本文

3、嘗試分離純化南極大磷蝦脂肪酶并對其相關(guān)的酶學(xué)性質(zhì)進行研究。
　　本文共有兩部分:
　　第一部分:南極大磷蝦脂肪酶分離純化
　　實驗中,酶活性測定方法采用不同碳鏈長度的兩種人工底物pNPB(對硝基苯酚丁酸酯)、pNPP(對硝基苯酚棕櫚酸酯)為實驗底物。以南極大磷蝦蝦頭為材料經(jīng)過粗提、DEAE Sepharose Fast Flow離子交換層析和Sephacryl S100凝膠過濾層析對其脂肪酶進行分離純化。
　　在

4、提取純化實驗中,發(fā)現(xiàn)水解pNPP的脂肪酶可能含量較少,采用35~80％的硫酸銨濃度鹽析,實驗只進行到離子交換層析,獲得兩個酶活性峰,純化倍數(shù)達到6.59;水解pNPB類脂肪酶含量較大,采用50~80%的硫酸銨濃度鹽析,離子交換層析及凝膠過濾柱層析均只有一個活性峰,最后經(jīng)SDS-PAGE得到單一條帶,說明經(jīng)過一系列純化步驟得到了較純的樣品,分子量約為42.81kDa,純化倍數(shù)達到5.41。
　　第二部分:脂肪酶部分酶學(xué)性質(zhì)研究

5、>　　酶學(xué)性質(zhì)研究實驗對前期實驗純化所得的南極大磷蝦水解pNPB類脂肪酶的部分酶學(xué)性質(zhì)進行了研究。
　　反應(yīng)溫度對酶促反應(yīng)速率的影響結(jié)果顯示,在5℃~25℃范圍內(nèi),該脂肪酶酶活力比較穩(wěn)定,即使在5℃仍具有較高的酶活性,對較高溫度穩(wěn)定性差;在35℃具有最佳反應(yīng)速率,具有低溫脂肪酶的催化特性,這可能與其生活環(huán)境相關(guān)。
　　反應(yīng)pH對酶促反應(yīng)速率的影響結(jié)果顯示,最佳反應(yīng)pH為8.0左右;在4℃低溫條件下,該酶具有較好的 pH穩(wěn)定性

6、,在 pH6~10范圍內(nèi),酶活力都保持在60%以上。
　　不同濃度金屬離子對酶促反應(yīng)速率的影響結(jié)果顯示,Mn2+(<0.5mmol/L)、Cu2+(≥0.1mmol/L)對南極大磷蝦脂肪酶有一定的抑制作用,前者濃度達到5mmol/L時有輕微促進作用; Mg2+(≤0.4mmol/L)和 Ca2+(≤0.4mmol/L)對南極大磷蝦脂肪酶有輕微的促進作用,但當(dāng)濃度達到0.5mmol/L時,改為急促的抑制作用;K+在0~0.3mmol