黑曲霉乳糖酶基因的克隆及其在畢赤酵母中的表達(dá).pdf

1、乳及乳制品是人類改善營(yíng)養(yǎng)、增強(qiáng)體質(zhì)的理想食品。牛乳中含有5％左右的乳糖，我國(guó)人群中有很大一部分人(約75％～95％)患有乳糖不耐受癥，嚴(yán)重影響乳及乳制品的推廣。乳糖酶能將乳制品中的乳糖水解為半乳糖和葡萄糖，利用乳糖酶生產(chǎn)低乳糖制品或口服酶制劑，能夠有效解決“乳糖不耐癥”問題。 本研究從一株產(chǎn)乳糖酶的黑曲霉Aspergillus niger DL116中克隆獲得乳糖酶DNA和cDNA序列，經(jīng)過序列分析顯示，乳糖酶基因DNA序列長(zhǎng)

2、3368 bp，其中含有8個(gè)內(nèi)含子，cDNA編碼區(qū)長(zhǎng)2967 bp，GC含量為52.8％，共編碼988個(gè)氨基酸，氨基酸序列中共含有12個(gè)潛在的N-糖基化位點(diǎn)。此基因已在GENBANK中注冊(cè)，登錄號(hào)為：ACCESSION No.EF103141。 將乳糖酶cDNA序列克隆到分泌型酵母表達(dá)載體pPIC9K上，電擊轉(zhuǎn)化Pichiapastoris GS115，經(jīng)過MM、MD平板篩選出156株GS115 His<'+>Mut<'+>表

3、型轉(zhuǎn)化子，并對(duì)重組酵母進(jìn)行乳糖酶基因的PCR分析，選取65株P(guān)CR檢測(cè)陽性的酵母轉(zhuǎn)化子進(jìn)行乳糖酶活性篩選，獲得一株高效表達(dá)乳糖酶的重組酵母工程菌，將此菌株命名為L(zhǎng)AC-47，對(duì)其進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)，甲醇誘導(dǎo)12 d后乳糖酶活力達(dá)到271.15 U/mL，表達(dá)量為0.66mg/mL。 將發(fā)酵液經(jīng)過超濾濃縮、透析、DEAE-52纖維素離子交換層析及Sephacry1<'TM>S-200分子篩層析進(jìn)行分離純化。純化后該酶經(jīng)PAGE電泳鑒定

4、為單一條帶，達(dá)到電泳純，單亞基分子量為130～140 kD，比活力從粗酶液的275.5 U/mg提高到532.9U/mg。 對(duì)表達(dá)的乳糖酶進(jìn)行了酶學(xué)性質(zhì)的研究，其酶促反應(yīng)最適溫度為60℃，60℃下保溫1 h酶活基本不變；最適反應(yīng)pH在3.0～4.2之間，并且pH穩(wěn)定性較好，在pH2.5～9.0范圍內(nèi)較穩(wěn)定，尤其在pH7.5～9.0范圍內(nèi)處理2 d，酶活均保持在94％以上，說明該酶有很好的耐堿性。所試離子和化學(xué)試劑對(duì)酶促反應(yīng)的影