黑曲霉纖維二糖酶基因在酵母細(xì)胞中的表達(dá).pdf

1、纖維二糖酶(CB)是纖維素酶的重要組分之一，在纖維素酶協(xié)同水解纖維素過程中發(fā)揮著重要的作用。目前工業(yè)生產(chǎn)的纖維素酶制劑CB活力較低，不利于纖維素的水解糖化。為促進(jìn)纖維素酶對纖維素的水解，提高纖維素酶系中CB活力就具有重要意義。本文研究了黑曲霉(Aspergillus niger)纖維二糖酶基因(bgl)在酵母中的表達(dá)，在搖瓶中對產(chǎn)酶條件進(jìn)行了優(yōu)化，并探討了重組酵母表達(dá)的CB協(xié)同里氏木霉(Trichoderma reesei)纖維素酶水解

2、纖維素的能力。
　　 使用整合型質(zhì)粒在釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中表達(dá)黑曲霉bgl基因。使用遺傳霉素(G418)篩選得到7株轉(zhuǎn)化子，PCR驗證表明轉(zhuǎn)化子的基因組中都已整合入bgl基因，但酒精發(fā)酵試驗表明，釀酒酵母轉(zhuǎn)化子不能利用纖維二糖產(chǎn)酒精，發(fā)酵液中也檢測不到CB活力。造成這種結(jié)果的原因可能是釀酒酵母對CB過糖基化修飾而使其失活。
　　 在畢赤酵母(Pichia pastoris)中使用

3、pPIC9K表達(dá)了黑曲霉bgl基因，通過G418篩選得到一株高拷貝轉(zhuǎn)化子。對高拷貝轉(zhuǎn)化子的PCR驗證結(jié)果表明，黑曲霉bgl基因以插入的形式整合入畢赤酵母基因組中，酵母本身的醇氧化酶Ⅰ基因沒有被破壞，所以轉(zhuǎn)化子可高效利用甲醇。酶活驗證試驗表明轉(zhuǎn)化子能分泌表達(dá)有活力的CB。蛋白電泳的結(jié)果顯示，畢赤酵母表達(dá)的CB的分子量約為130kD，比黑曲霉CB高出10kD。雖然在分子量上有差異，但畢赤酵母表達(dá)的CB與黑曲霉CB的最適溫度和最適pH值是一致

4、的。
　　 研究了重組畢赤酵母在復(fù)合誘導(dǎo)(BMMY)培養(yǎng)基和葡萄糖玉米漿粉(YG)培養(yǎng)基中的產(chǎn)酶效果，并對發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果表明，采用BMMY培養(yǎng)基為產(chǎn)酶培養(yǎng)基時，在優(yōu)化后的條件下，重組酵母發(fā)酵8d后發(fā)酵液中CB活力為11.8 IU/mL，是優(yōu)化前的1.37倍。而在YG培養(yǎng)基中，重組酵母在優(yōu)化后的條件下發(fā)酵8d發(fā)酵液中CB活力為9.01IU/mL。雖然重組酵母在BMMY培養(yǎng)基中的酶產(chǎn)量要高于在YG培養(yǎng)基中的酶產(chǎn)量，但后者具

5、有成本低和操作簡便的優(yōu)勢，所以更適合作為重組畢赤酵母的產(chǎn)酶培養(yǎng)基。
　　 以稀酸預(yù)處理的玉米芯纖維殘渣為底物研究了畢赤酵母表達(dá)的CB協(xié)同里氏木霉纖維素酶水解纖維素的能力。結(jié)果表明，畢赤酵母表達(dá)的CB與黑曲霉CB在協(xié)同纖維素酶水解纖維素的能力上沒有差別，通過添加CB，酶解得率從62.4％提高到80.7%。對酶解參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化，在優(yōu)化后的條件下酶解72h，酶解得率達(dá)到了93.1%。但適宜的酶解時間為48h。
　　 本文將黑曲