宇佐美曲霉酸性蛋白酶基因在黑曲霉中表達的研究.pdf

1、酸性蛋白酶是一類最適pH為2.5～5.0的天冬氨酸蛋白酶。真菌酸性蛋白酶能在低pH條件下，有效水解蛋白質，被廣泛應用于酒精、釀酒、食品加工、飼料添加、皮革加工等行業(yè)中，是酶制劑產(chǎn)業(yè)的一個重要產(chǎn)品，具有很好的商業(yè)開發(fā)價值。宇佐美曲霉(aspergillus usamii)是傳統(tǒng)的酸性蛋白酶發(fā)酵生產(chǎn)菌，目前利用常規(guī)的育種方法提高其產(chǎn)量的潛力已經(jīng)非常有限，通過基因工程技術培育工程菌是獲得酸性蛋白酶高產(chǎn)菌株的有效途徑。
　　 黑曲霉是一

2、種因其酶系豐富、代謝產(chǎn)物多而被廣泛應用的工業(yè)生微生物。黑曲霉作為基因工程的受體菌有著與細菌、酵母不同的獨特優(yōu)點--具有很高的蛋白質分泌能力，一些糖化酶生產(chǎn)菌種在理想的培養(yǎng)條件下發(fā)酵分泌糖化酶的產(chǎn)率可達20g/L發(fā)酵液：能夠正確進行各種翻譯后加工，并且與高等真核生物類似；同時又是公認的安全生產(chǎn)菌株，發(fā)酵及后處理技術成熟。宇佐美曲霉與黑曲霉同為曲霉屬，具有相同的基因表達調控機制。因此以黑曲霉糖化酶基因啟動子調控宇佐美曲霉酸性蛋白酶基因的表達

3、，有望獲得高效表達酸性蛋白酶的黑曲霉工程菌，從而達到提高酸性蛋白酶產(chǎn)量和簡化發(fā)酵條件的目的。
　　 本研究以宇佐美曲霉(aspergillus usamii)為基因供體，通過重疊延伸PCR將宇佐美曲霉酸性蛋白酶基因pepA與黑曲霉糖化酶基因的5’同源臂和3’同源臂進行拼接，構建pepA基因的表達框，使酸性蛋白酶基因受糖化酶啟動子的調控。進一步構建黑曲霉表達載體，通過農(nóng)桿菌介導法轉化黑曲霉菌絲體，培育酸性蛋白酶工程菌。主要研究結果

4、如下：
　　 1.黑曲霉表達載體的構建
　　 采用PCR擴增方法，分別獲得宇佐美曲霉中的酸性蛋白酶基因pepA，黑曲霉糖化酶基因的上游片段GLA5和下游片段GLA3。運用重疊延伸PCR，將GLA5、GLA3與pepA基因拼接，得到酸性蛋白酶同源重組表達框GLA5-pepA-GLA3。構建農(nóng)桿菌介導轉化黑曲霉的表達載體pSZH-pepA，其T-DNA區(qū)順向連接酸性蛋白酶基因和潮霉素基因兩個同源重組表達框。
　　 2

5、.農(nóng)桿菌介導的黑曲霉菌絲體遺傳轉化體系的建立與優(yōu)化
　　 從潮霉素B和頭孢噻肟鈉的篩選壓力、乙酰丁香酮濃度、培養(yǎng)基的選擇、黑曲霉菌齡、共培養(yǎng)時間以及共培養(yǎng)溫度等方面，對農(nóng)桿菌介導的黑曲霉菌絲體遺傳轉化體系進行摸索，最終確定以PDA作為共培養(yǎng)培養(yǎng)基，乙酰丁香酮濃度為200μmol/L的條件下，用菌齡為5d的黑曲霉菌絲體與攜帶表達載體的農(nóng)桿菌，在28℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置共培養(yǎng)48h為最佳轉化條件。
　　 3.酸性蛋白酶基因在黑

6、曲霉中表達
　　 以高產(chǎn)糖化酶的黑曲霉工業(yè)生產(chǎn)菌種為受體菌，采用根癌農(nóng)桿菌介導法將表達載體pSZH-pepA轉化黑曲霉菌絲體，經(jīng)PCR鑒定，在69株穩(wěn)定遺傳的菌株中，共有37株為陽性菌株，其中3株為同源重組轉化子。挑取穩(wěn)定轉化子于糖化酶糖化酶搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中，34℃條件下300r/min培養(yǎng)3d。取培養(yǎng)液上清，經(jīng)TCA法濃縮蛋白后，進行SDS-PAGE，得到約40Kda酸性蛋白酶條帶，說明在糖化酶生產(chǎn)條件下，轉入的酸性蛋白酶基因

7、獲得了表達。進一步對重組菌株的發(fā)酵液上清進行福林-酚法測定酶活，結果表明，酸性蛋白酶基因在黑曲霉中得到了表達，酶活最高達45.56U/mL，而在出發(fā)菌株中檢測到的酸性蛋白酶酶活僅為3.72U/mL，說明轉入的pepA基因已在糖化酶基因啟動子調控下獲得了表達。
　　 4.黑曲霉重組菌株搖瓶發(fā)酵條件的優(yōu)化
　　 將重組菌株在不同條件下?lián)u瓶發(fā)酵，探討pH、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時間對產(chǎn)酶量的影響，確定適合重組菌搖瓶發(fā)酵的條件。結果表明