黑曲霉脂肪酶A在畢赤酵母細胞表面的展示研究.pdf

1、黑曲霉被美國食品和藥品管理局(FDA)認定為GRAS生物,其產(chǎn)生的脂肪酶催化水解或合成甘油三酯具有高度的1,3-位置特異性,廣泛應用于食品添加劑、油脂改性、手性化合物拆分及清潔添加劑等領域。然而,目前其主要以游離態(tài)形式予以應用,在有機溶劑中易失活,并難以回收重復利用,生產(chǎn)成本高。針對游離態(tài)酶在應用中的上述缺陷,擬利用微生物表面展示技術將黑曲霉脂肪酶A(ANLA)展示于酵母細胞表面,在提高酶穩(wěn)定性的同時,實現(xiàn)脂肪酶的表達、固定及純化一體化

2、、簡單化。同時,考慮到有諸多因素影響著展示脂肪酶的活力,本研究在前期實驗室篩選的釀酒酵母細胞壁蛋白Sed1錨定蛋白的基礎上,以畢赤酵母X-33(釀酒酵母存在過度糖基化現(xiàn)象)為宿主,探討了不同連接序列和啟動子對展示ANLA酶活力的影響,以期為開發(fā)性能良好的黑曲霉脂肪酶全細胞催化劑提供新的理論探討和技術支持。主要研究工作和結果摘要如下:
　　1.以酵母細胞壁蛋白Sed1為錨定蛋白,在Sed1與ANLA之間插入不同的連接序列,構建六種基

3、于不同連接序列的表面展示系統(tǒng)。經(jīng)過篩選各獲得1株酶活力較高的重組菌株,分別為X-33/pAOX-A0S89＃,X-33/pAOX-AGS44＃,X-33/pAOX-AS1S44＃,X-33/pAOX-AS2S32＃,X-33/pAOX-AS3S42＃,X-33/pAOX-AS4S62＃。采用Fisher法(α=0.05)對六株重組菌株的酶活力進行多重比較,結果顯示X-33/pAOX-AGS44＃酶活最高,可達到24.96U/g干細胞,略

4、大于X-33/pAOX-AS1S44＃酶活(22.74U/g干細胞),兩者均顯著大于其余四株重組菌株的酶活。利用流式細胞儀對六株重組菌株展示效率進行檢測分析,X-33/pAOX-AGS44＃的展示率最高,達94.58％,而X-33/pAOX-AS1S44＃的展示率最低,僅為61.57%。上述結果表明,選用(G4S)3為連接序列構建的重組菌株X-33/pAOX-AGS44＃展示ANLA的效果最佳。展示ANLA的最適溫度和最適pH分別為45

5、°C,pH7.5,與游離酶一致,但穩(wěn)定性有所提高。
　　2.構建誘導型表面展示載體pFLD-AGS和組成型表面展示載體pGAP-AGS,pTEF-AGS,分別將其電轉入畢赤酵母X-33中,經(jīng)篩選各獲得1株酶活力較高的重組菌株,分別為X-33/pFLD-AGS35＃,X-33/pGAP-AGS19＃,X-33/pTEF-AGS77＃。對三株重組菌與之前獲得的X-33/pAOX-AGS44＃酶活力進行多重比較分析,結果表明X-33/p

6、AOX-AGS44＃與X-33/pFLD-AGS35＃之間酶活無顯著差別,但顯著大于另兩株的酶活,而X-33/pTEF-AGS77＃酶活顯著小于其它三株重組菌株。
　　3.分別對X-33/pAOX-AGS44＃,X-33/pFLD-AGS35＃,X-33/pGAP-AGS19＃的搖瓶發(fā)酵條件進行優(yōu)化,在甲醇誘導時間為72h,初始pH為6.0,每24h甲醇添加量為1%,接種量為6%,裝液量為50mL的條件下,X-33/pAOX-AG

7、S44＃展示ANLA的酶活力最高可達到38.02U/g干細胞;在甲醇誘導時間為72h,初始pH為7.5,每24h甲醇添加量為2%,接種量為2%,裝液量為40mL的條件下,X-33/pFLD-AGS35＃展示ANLA的酶活力可達30.46U/g干細胞;在以油酸作為碳源,氮源蛋白胨及酵母提取物濃度分別為4%,1%,初始pH為6.5,接種量為2%,裝液量為50mL,培養(yǎng)時間為48h的條件下,X-33/pGAP-AGS19＃展示ANLA的酶活力