在畢赤酵母表面共展示具有協(xié)同效應的米根霉脂肪酶和褶皺假絲酵母脂肪酶LIP1的研究.pdf

1、表面展示技術(shù)可以將脂肪酶以融合蛋白的形式通過錨定蛋白展示在微生物細胞表明，并保持其相對獨立的空間構(gòu)象。利用該技術(shù)作為脂肪酶固定化的一種方法，制備綠色全細胞生物催化劑，可以解決游離酶易失活、難以回收利用等缺點。米根霉脂肪酶（Rhizopus oryzae lipase，ROL）在油脂加工和食品工業(yè)等方面擁有廣闊應用前景，但天然酶表達量少、酶活較低限制了其工業(yè)化應用；已有研究證實在生物柴油制備工藝中，褶皺假絲酵母脂肪酶與米根霉脂肪酶存在協(xié)同

2、催化作用，可大幅提高生物柴油轉(zhuǎn)化率。基于此，本研究采用基因工程手段將米根霉脂肪酶和褶皺假絲酵母脂肪酶LIP1（Candida rugosa lipase1，CRL1）共展示在畢赤酵母細胞表面，作為全細胞催化劑用于催化烏桕籽油生物柴油制備，以為生物柴油制備工藝開辟新途徑。主要研究工作及結(jié)果摘要如下：
　?。?）首次克隆含前序列的米根霉脂肪酶基因（proROL）構(gòu)建基于 pPIC9K的展示載體 KpRS，將米根霉脂肪酶展示在畢赤酵母

3、GS115細胞表面；通過抗性平板和三丁酸甘油酯酶活檢測平板篩選，獲得一株水解橄欖油酶活高達121.99U/g干細胞的重組菌株。經(jīng)免疫反應處理后，通過正置熒光顯微鏡檢測到明亮的綠色熒光，經(jīng)流式分析展示率高達97.48％。該單展示ROL的重組菌株制備的全細胞催化劑酶學性質(zhì)為：最適碳鏈長度為C8，最適溫度為45℃，最適pH為7.6；與游離酶存在微小差別。
　?。?）克隆經(jīng)優(yōu)化的褶皺假絲酵母脂肪酶lip1基因（CRL1），構(gòu)建基于pPIC

4、Zα的畢赤酵母展示系統(tǒng)；經(jīng)抗性平板和三丁酸甘油酯酶活檢測平板篩選，獲得一株水解橄欖油酶活高達359.62 U/g干細胞的重組菌株。經(jīng)免疫反應處理后，通過正置熒光顯微鏡檢測到明亮的紅色熒光，流式分析其展示率高達96.50％。經(jīng)酶學性質(zhì)分析，展示CRL1最適碳鏈長度為C8，與游離酶存在差別；最適溫度和pH為40℃、7.8~8.0，與游離酶保持一致。
　?。?）將表達載體KpRS和ZCS分別電轉(zhuǎn)化GS115/ZCS和GS115/KpRS

5、單展重組菌株，經(jīng)雙重抗性平板和三丁酸甘油酯酶活檢測平板篩選，分別獲得一株GS115/CpRS重組菌株（水解橄欖油酶活高達405.00 U/g干細胞）和另一株GS115/pRCS重組菌株（酶活高達470.59 U/g干細胞）。較單展示ROL重組子和單展示 CRL1重組子分別提高了約3.9倍和1.3倍。將共展重組子 GS115/CpRS和GS115/pRCS分別經(jīng)過免疫反應處理后，在正置熒光顯微鏡下均可以觀察到明顯的綠色和紅色熒光；流式分析

6、結(jié)果顯示，共展示重組子GS115/CpRS中ROL和CRL1展示率分別為97.75％和98.91％，重組子GS115/pRCS則分別為98.81％和97.14％；表明共展示成功。對共展示ROL和CRL1全細胞催化劑的酶學性質(zhì)分析表明，最適碳鏈長度為C8，最適溫度為40℃，最適pH為8.0。
　　（4）將展示重組子作為全細胞催化劑催化烏桕籽油制備生物柴油，對其反應條件進行了初步優(yōu)化。共展示系統(tǒng)構(gòu)建的ROL和CRL1復合酶催化體系的脂