人可溶性TRAIL基因的克隆及其在畢赤酵母中的分泌表達(dá).pdf

1、腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand,TRAIL)是一種凋亡誘導(dǎo)因子,它是繼TNF、FasL之后發(fā)現(xiàn)的又一個TNF家族成員,又稱凋亡素-2配體(apoptosis-2ligand,Apo2L).人源的TRAIL是一種Ⅱ型單跨膜蛋白,在機(jī)體各組織中均呈現(xiàn)組成性表達(dá),可特異性誘導(dǎo)誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞的凋亡,而對大多數(shù)正常細(xì)胞無殺傷作用.TRA

2、IL<,114~281>的胞外部分,即可溶性TRAIL(soluble TRAIL,sTRAIL)與全長的TRAIL具有相同強(qiáng)度的誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用.本研究的主要工作是:利用甲醇營養(yǎng)型酵母(Pichia pastoris)分泌表達(dá)人sTRAIL/TRAIL<,114~281>分子.具體來講,即:用PCR方法擴(kuò)增出sTRAIL的cDNA序列,將其插入到穿梭質(zhì)粒pPIC9K的MF α信號肽序列后、醇氧化脫氫酶1(AOX1)啟動子的下游,

3、得到重組質(zhì)粒pPIC9K-sTRAIL.經(jīng)Sal I酶切線性化后,用聚乙二醇(PEG)1 000法將其轉(zhuǎn)化到畢赤酵母宿主菌GS115,經(jīng)篩選得到sTRAIL分泌表達(dá)菌株,SDS-PAGE及Western-blotting確認(rèn)表達(dá),L929細(xì)胞測定表達(dá)產(chǎn)物的活性.實驗結(jié)果如下:畢赤酵母分泌表達(dá)的sTRAIL,SDS-PAGE分析占總蛋白的20%.用抗人sTRAIL單抗可以確認(rèn)表達(dá)了sTRAIL重組分子,L929細(xì)胞檢測表明,表達(dá)產(chǎn)物可誘導(dǎo)