人β-防御素-3在畢赤酵母中的分泌表達(dá)及活性研究.pdf

1、抗菌肽是生物體產(chǎn)生的一種陽離子小分子肽，多數(shù)具有廣譜抗菌活性，是生物先天性免疫的重要組成成分。目前，已在許多生物體內(nèi)，包括：昆蟲、鳥類、動(dòng)物、植物及原核生物中發(fā)現(xiàn)1000多種具有抗菌活性的肽?？咕牡闹苽浞椒ㄖ饕猩锊牧咸崛》?、化學(xué)合成法和基因工程表達(dá)法3種。由于抗菌肽在生物組織中含量低、分離提取困難，除少數(shù)幾種昆蟲抗菌肽外，提取法難以滿足生產(chǎn)應(yīng)用的需要，僅用于氨基酸序列分析和初步的抗菌試驗(yàn)?；瘜W(xué)合成法可以提高產(chǎn)量，但差錯(cuò)率和副反應(yīng)隨

2、分子量增大而增加，一般超過50個(gè)氨基酸殘基的肽段即難以用化學(xué)法合成，并且化學(xué)合成法成本很高，所以，僅用于結(jié)構(gòu)和性質(zhì)分析及藥理實(shí)驗(yàn)，難以應(yīng)用于實(shí)際生產(chǎn)。由于抗菌肽結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、氨基酸殘基未被翻譯后修飾，因此，基因工程表達(dá)法是大量生產(chǎn)抗菌肽的理想途徑?，F(xiàn)在，已有很多陽離子抗菌肽成功的用基因工程進(jìn)行了表達(dá)，如magainins、殺菌肽、buforins及其模擬肽。由于抗菌肽基因一般都較小，故采用人工合成的方法來獲取目的基因，再通過基因工程方法進(jìn)行

3、微生物發(fā)酵生產(chǎn)抗菌肽則更具有實(shí)際意義。因此，本研究以β-防御素-3(HBD-3)為研究對(duì)象，應(yīng)用基因工程技術(shù)研制出重組HBD-3，并將重組HBD-3在畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行表達(dá)，研究其抗菌活性，為重組抗菌肽的產(chǎn)業(yè)化奠定基礎(chǔ)。
　　 研究目的
　　 1.應(yīng)用DNA重組技術(shù)構(gòu)建抗菌肽HBD-3高效表達(dá)載體，誘導(dǎo)表達(dá)出具有抗菌活性的重組抗菌肽。
　　 2.分析抗菌肽的熱穩(wěn)定性、抑菌活性等特性，為抗菌肽的活性研究和應(yīng)用提供

4、科學(xué)依據(jù)。
　　 研究方法
　　 1.HBD-3基因的克隆鑒定：將人工合成的HBD-3基因利用酶切、連接，克隆到真核表達(dá)載體pGAPZαA中，構(gòu)建成重組質(zhì)粒HBD-3-pGAPZα，進(jìn)行測(cè)序鑒定；將重組質(zhì)粒其轉(zhuǎn)入E.coli感受態(tài)細(xì)胞JM109，擴(kuò)增質(zhì)粒，篩選陽性克隆，挑選單菌落進(jìn)行PCR檢測(cè)。
　　 2.HBD-3蛋白表達(dá)與鑒定：提取測(cè)序正確的E.coli JM109進(jìn)行增菌培養(yǎng)，大量提取質(zhì)粒；用BspA I進(jìn)

5、行單酶切，線性化重組載體，將重組載體電轉(zhuǎn)化至畢赤酵母SMD1168感受態(tài)細(xì)胞，用PCR進(jìn)行檢測(cè)鑒定；在GAP啟動(dòng)子調(diào)控下，誘導(dǎo)表達(dá)重組HBD-3，通過Tricine-SDS-PAGE鑒定重組HBD-3蛋白表達(dá)情況。
　　 3.應(yīng)用瓊脂孔擴(kuò)散法對(duì)重組抗菌肽HBD-3的活性進(jìn)行檢測(cè)：將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的懸浮液與LB固體培養(yǎng)基混勻后鋪板，等其凝固后，用打孔器打孔，滴加重組的HBD-3表達(dá)上清，37℃培養(yǎng)，過夜，

6、以同體積pGAPZαA空載體轉(zhuǎn)化SMD1168酵母表達(dá)蛋白為對(duì)照，同時(shí)加入等體積的重組抗菌肽(Grahamin1、Grahamin2、Astacidin2、LL-37、HNP1、HsAFP1)作為對(duì)照，第2天測(cè)量抑菌直徑。
　　 4.重組HBD-3最小抑菌濃度測(cè)定：將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的金黃色葡萄球菌，分別接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，將不同濃度的重組HBD-3加入培養(yǎng)孔，混勻，置37℃培養(yǎng)箱孵育24h后，用紫外分光光度計(jì)測(cè)量重組抗菌肽

7、HBD-3的最小抑菌濃度。
　　 5.重組HBD-3熱穩(wěn)定性測(cè)定：將重組抗菌肽HBD-3經(jīng)過不同時(shí)間的沸水浴后進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，觀察其對(duì)金黃色葡萄球菌抗性的變化，同時(shí)以pGAPZαA空載體轉(zhuǎn)化酵母的表達(dá)上清和未煮沸的HBD-3抗菌肽作對(duì)照。
　　 研究結(jié)果
　　 1.成功構(gòu)建HBD-3-pGAPZαA重組質(zhì)粒，通過PCR挑選陽性克隆并測(cè)序，結(jié)果表明，所合成的重組質(zhì)粒與設(shè)計(jì)序列完全一致。
　　 2.通過1％瓊脂

8、糖凝膠電泳鑒定，結(jié)果表明，線性化的重組質(zhì)粒成功電轉(zhuǎn)化到畢赤酵母SMD1168感受態(tài)細(xì)胞中。在GAP啟動(dòng)子調(diào)控下，重組HBD-3在畢赤酵母中得到表達(dá)。Tricine-SDS-PAGE對(duì)重組HBD-3的鑒定結(jié)果表明，重組HBD-3的分子量約為5.0KD。
　　 3.應(yīng)用瓊脂孔擴(kuò)散法對(duì)重組抗菌肽的活性進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明，重組HBD-3對(duì)金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度為5μg/ml；重組HBD-3的熱穩(wěn)定性較好，100℃20min不能破壞