重復(fù)序列類人膠原蛋白表達(dá)載體的構(gòu)建及在畢赤酵母中的分泌表達(dá).pdf

1、碩士論文高重復(fù)序列類人膠原蛋白表達(dá)載體的構(gòu)建及在畢赤醉母中的分泌表達(dá)摘要膠原蛋白約占脊椎動(dòng)物總蛋白的3仍‘，對(duì)維護(hù)細(xì)胞、組織、器官的正常生理功能和損傷修復(fù)有重要作用。基于人m型膠原蛋白Ql鏈膠原域Gly一X一Y(甘氨酸口X.Y)的三膚重復(fù)序列特征，設(shè)計(jì)井人工合成了一段類人膠原蛋白基因單體州.通過一系列體外酶切連接，利用大腸桿菌作為克隆宿主，最終構(gòu)建了含有同向六串聯(lián)類人膠原蛋白基因單體的類人膠原蛋白表達(dá)載體pplCgKO6，通過酶切和DN

2、A測(cè)序鑒定構(gòu)建成功.將pPICgKG6電轉(zhuǎn)化畢赤酵母Gslls，經(jīng)G418篩選得到高拷貝重組酵母，選取高表達(dá)菌株進(jìn)行甲醇誘導(dǎo)表達(dá)類人膠原蛋白，經(jīng)SDS一以O(shè)E檢測(cè)表明，類人膠原蛋白得到分泌表達(dá)，其表觀分子量為112kDao對(duì)得到的工程菌進(jìn)行初步優(yōu)化誘導(dǎo)條件，得出最佳組合為甲醇添加量為1.soof24b:初始菌濃為3.ooD和斌即工收獲時(shí)間為60h:初始PH為6.6時(shí)類人膠原蛋白的產(chǎn)量從優(yōu)化前約8.6m叭提高到約60.lmglL。嘗試初步

3、分離類人膠原蛋白，結(jié)果表明在硫酸按飽和度40%~60%進(jìn)行鹽析或丙酮濃度40%一80%進(jìn)行沉淀可以獲得類人膠原蛋白粗品。為實(shí)現(xiàn)用酵母工程菌發(fā)酵法制備類人膠原蛋白及其在醫(yī)學(xué)材料領(lǐng)域的應(yīng)用奠定了良好的基礎(chǔ)。關(guān)鍵詞:類人膠原蛋白，基因串聯(lián)，畢赤酵母，高拷貝，分泌表達(dá)碩士論文高重復(fù)序列類人膠原蛋白表達(dá)載體的構(gòu)建及在畢赤醉母中的分泌表達(dá)符號(hào)與縮略語說明州以m讓印多側(cè)m)..，.，...，，，.，.，二，.....................微

4、克匹(面crolit鄺)二‘.......二，.......，..，........。.‘..........微升AmP(帥picinin)，....?！?，....。.‘.............................氨節(jié)青霉素DNA(deox州bon訓(xùn)leic公id)，.，，........，，.，，，，........，脫氧核糖核酸RNA(ribonuCI咖心d).......，...........，.........

5、.，........核搪核酸PCR(po】ymerasechain代漁Ction).。........。二，，二。...聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)bP(加即州r).......，.。.。二。.。.。..。二。....................堿基對(duì)kbP(酥ilobaseP川r)二。.，.。..，....................，...，.千堿基對(duì)dNTP(deoxy一nucleotide腸PhoSP抽此)‘，‘.，.‘.，脫氧核昔三

6、磷酸EB(ethldiumbromide).................，。..。，，.....，二。二，....，澳化乙錠BSA(bov嘛價(jià)目bUmin)..，.。..，，.，，。.。二，..，..牛血清白蛋白EI〕TA(ethy】enedi田刀InetetraCetic即id)............，...........乙二胺四乙酸kDa(kil。翻加n)........，.，...........，...........，

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