二硫鍵穩(wěn)定的人源性抗bFGF雙鏈抗體抑制人肺癌細(xì)胞生長(zhǎng)的作用研究.pdf

1、目的:研究二硫鍵穩(wěn)定的人源性抗bFGF雙鏈抗體（抗bFGF的ds-Diabody）對(duì)人肺癌A549細(xì)胞的體內(nèi)外生長(zhǎng)抑制作用及其抗腫瘤作用機(jī)制。
　　方法:將轉(zhuǎn)入抗bFGF的ds-Diabody基因的酵母工程菌GS115接種于酵母生長(zhǎng)培養(yǎng)基中進(jìn)行生長(zhǎng)培養(yǎng)，生長(zhǎng)培養(yǎng)48 h后將培養(yǎng)基換成誘導(dǎo)培養(yǎng)基，加入1％的甲醇進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)。酵母誘導(dǎo)培養(yǎng)上清通過硫酸銨沉淀法進(jìn)行初步純化，并通過鎳離子親和層析和陰離子交換層析的方法純化得到抗bFGF的d

2、s-Diabody。酵母表達(dá)及純化產(chǎn)物通過SDS-PAGE進(jìn)行鑒定，并利用間接ELISA的方法檢測(cè)純化獲得的抗bFGF的ds-Diabody的抗原結(jié)合活性。體外培養(yǎng)人肺癌A549細(xì)胞，利用Cell Counting Kit-8（CCK-8試劑盒）檢測(cè)該抗體對(duì)人肺癌A549細(xì)胞增殖的影響。Western blot分析抗bFGF的ds-Diabody對(duì)人肺癌A549細(xì)胞中Akt和MAPK信號(hào)通路的影響。通過劃痕實(shí)驗(yàn)分析抗bFGF的ds-Di

3、abody對(duì)人肺癌A549細(xì)胞遷移能力的影響，利用Transwell小室分析該抗體對(duì)人肺癌A549細(xì)胞侵襲能力的影響。建立人肺癌裸鼠皮下異體移植瘤模型，研究抗bFGF的ds-Diabody對(duì)人肺癌A549細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)生長(zhǎng)的影響。裸鼠皮下接種腫瘤細(xì)胞7天后，當(dāng)出現(xiàn)明顯的腫瘤塊時(shí)（直徑≥5mm），將小鼠隨機(jī)分成三組，并開始給藥，每三天給一次藥，總共給六次藥。每次給藥前，稱量各組裸鼠體重，測(cè)量裸鼠皮下移植瘤的體積。在第一次給藥后的不同時(shí)間點(diǎn)

4、（1h,71h,143h和215h）收集20μL的小鼠血樣利用間接ELISA的方法檢測(cè)血樣中抗體的殘留量。免疫組化法檢測(cè)裸鼠皮下異體移植瘤中微血管密度和淋巴管密度。
　　結(jié)果:甲醇誘導(dǎo)酵母工程菌GS115在上清中分泌表達(dá)抗bFGF的ds-Diabody，經(jīng)鎳離子親和層析和陰離子交換層析兩步法純化后獲得了純度大于90%的抗bFGF的ds-Diabody。間接ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明成功純化得到具有抗原結(jié)合活性的抗bFGF的ds-Dia

5、body?？筨FGF的ds-Diabody可呈濃度依賴性地抑制人肺癌A549細(xì)胞株的增殖，當(dāng)抗體濃度為100μg/mL時(shí)，對(duì)人肺癌A549細(xì)胞增殖抑制率為40.94%。抗bFGF的ds-Diabody可以有效地抑制bFGF/FGFR信號(hào)通路中相關(guān)蛋白的Akt和MAPK的磷酸化，該抗體以100μg/mL的濃度作用30min后，細(xì)胞內(nèi)的Akt和MAPK磷酸化水平顯著下降。腫瘤細(xì)胞劃痕和侵襲實(shí)驗(yàn)中，抗bFGF的ds-Diabody能顯著地抑制

6、人肺癌A549細(xì)胞的遷移和侵襲。抗bFGF的ds-Diabody作用于皮下異體移植人肺癌A549細(xì)胞的裸鼠，給藥6次后，腫瘤生長(zhǎng)抑制率達(dá)到86.54%；在第一次給藥后的不同時(shí)間點(diǎn)取小鼠血樣進(jìn)行抗體殘余量檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果表明抗bFGF的ds-Diabody在給藥過程中其抗體殘余量能維持在30%-40%，該抗體在小鼠體內(nèi)能維持相對(duì)穩(wěn)定。免疫組化試驗(yàn)結(jié)果表明，抗bFGF的ds-Diabody組的腫瘤組織中微血管密度和淋巴管密度均有顯著的下降。<