人源化氨基端脂多糖結(jié)合蛋白（NH-LBP）基因工程抗體的構(gòu)建及其生物學活性研究.pdf

1、內(nèi)毒素血癥是臨床創(chuàng)(燒)傷病人最常見的并發(fā)癥之一。作為基因工程抗體的scFv片段已成為目前研究中最常用的一種抗體形式，它是一種線性的多肽，相對分子質(zhì)量約為26kDa，是由重鏈的可變區(qū)(VH)和輕鏈的可變區(qū)(VL)通過一個柔性的肽段(Gly4Ser1)3連接而成的異二聚體，scFv是針對特異性抗原的具有較高親和力的抗體片段的最小功能分子。與體積較大的抗體片段如Fab'，F(xiàn)ab'2和IgG相比，scFv在非靶組織內(nèi)沉積較少，在血循環(huán)中的清除

2、速度快以及更易滲透入靶組織內(nèi)，由于這些優(yōu)點使得scFv具有廣闊的臨床應用前景。在scFv制備過程中抗體庫的容量大小是決定能否篩選出高親和力抗體的關鍵因素，而核糖體展示技術則易于構(gòu)建大容量的文庫(庫容約1012-1013左右)；減少細胞內(nèi)表達時所產(chǎn)生的差異性；更易產(chǎn)生突變，利于篩選出高親和力的抗體等。由于核糖體展示技術產(chǎn)生的文庫容量不受轉(zhuǎn)染的限制，因此更易于從抗體庫中篩選到抗原特異性scFv。 目的：通過基因工程技術構(gòu)建人源化sc

3、Fv抗體庫，采用核糖體展示技術在體外篩選與NH-LBP有較高親合力的scFv抗體及編碼的cDNA，在酵母細胞內(nèi)表達scFv抗體并初步觀察該抗NH-LBPscFv抗體在體內(nèi)外的生物學活性。 方法：一、用含有人LBP與LPS結(jié)合活性部位的穿梭質(zhì)粒pBacmidtLBP轉(zhuǎn)染sf21昆蟲細胞，獲得高滴度的重組病毒液；以此重組病毒液感染對數(shù)生長期的sf21昆蟲細胞進行表達，金屬親和樹脂純化含有NH-LBP的培養(yǎng)上清，SDS-PAGE電泳及

4、Western-Blot鑒定純化后產(chǎn)物。 二、分離健康人外周血淋巴細胞，用RT-PCR技術分別擴增抗體的VH和VL片段，將二者以SOE-PCR方法通過一段柔性肽段(Gly4Ser1)3連接起來構(gòu)成scFv抗體文庫。 三、應用PCR的方法使scFv抗體庫帶上T7啟動子，AUG啟動子、一段Kozak序列。運用核糖體展示技術在體外表達scFv抗體文庫，表達產(chǎn)物轉(zhuǎn)膜檢測目的片段，同時用NH-LBP標板篩選表達產(chǎn)物，篩選后的ARM

5、復合體進行RT-PCR反應，共進行5輪富集篩選。 四、應用基因重組的方法將篩選到的編碼抗NH-LBPscFv抗體的cDNA與pPMETaA相連，轉(zhuǎn)入嗜甲醇畢赤酵母細胞PMAD11中，甲醇誘導表達后將細胞裂解上清純化鑒定。 五、用所得scFv抗體干預FITC-LPS處理后的U937細胞，流式細胞儀檢測該抗體阻斷LPS與U937細胞的結(jié)合能力；同時用scFv抗體干預燒傷合并內(nèi)毒血癥小鼠動物模型，觀察不同時相點(1、3、6、1

6、2、24小時)小鼠肝、肺、腎等臟器的形態(tài)學變化，檢測各組小鼠血漿中炎性細胞因子TNF-a、IL-6濃度的變化。 結(jié)果：一、經(jīng)過桿狀病毒表達系統(tǒng)sf21昆蟲細胞的表達、金屬親和樹脂純化和鑒定后獲得相對分子質(zhì)量約為30kDa的NH-LBP，總量約2.624mg。 二、從人外周血淋巴細胞中擴增出抗體的VH(約340bp)和VL片段(325bp)，連接后得到人源化scFv抗體文庫(片段大小約為750bp)；將體外表達的scFv抗

7、體庫產(chǎn)物轉(zhuǎn)膜后檢測到相對分子質(zhì)量約為27kDa的目的條帶，經(jīng)過5輪體外表達、富集篩選后得到編碼可與NH-LBP高度結(jié)合的scFv抗體的cDNA。 三、編碼scFv抗體的cDNA測序后在GeneBank中進行序列比對，結(jié)果顯示序列中1-811bp編碼抗體的VH，812-856bp編碼linker，857-1200bp編碼抗體的VL，所得編碼scFv的cDNA序列正確。將核酸序列轉(zhuǎn)化為氨基酸序列后在GeneBank中的Immunog

8、lobinBLAST進行比對，顯示所得cDNA序列翻譯產(chǎn)物含有抗體的VH和VL部分。 四、編碼scFv抗體的cDNA轉(zhuǎn)染酵母細胞PMAD11，甲醇誘導表達72hrs后，細胞裂解上清經(jīng)SDS-PAGE電泳及Western-Blot鑒定，表達產(chǎn)物為相對分子質(zhì)量約35kDa的scFv抗體，總量約5.4062mg。 五、FCM檢測所得scFv抗體干預FITC-LPS與U937細胞的結(jié)合能力，結(jié)果顯示：較大量的scFv抗體能夠抑制

9、FITC-LPS與U937細胞的結(jié)合，吸收峰處于基線水平。 六、scFv抗體干預燒傷合并內(nèi)毒素血癥小鼠動物模型后，與模型組相比觀察發(fā)現(xiàn)肝竇內(nèi)充血減輕、炎性細胞浸潤不明顯，肝細胞腫脹也明顯減輕；肺組織的炎性滲出和肺泡間隔的充血水腫減輕、炎細胞減少；腎組織內(nèi)毛細血管擴張、炎性細胞浸潤不明顯。 血漿中TNF-α濃度在燒傷合并內(nèi)毒素處理后即顯著增高，3hrs達到頂峰，隨后逐漸降低，模型組各時相點與對照組相比，差異有顯著性(p＜0

10、.01，p＜0.05)。干預組與相應時相點的模型組相比，在最初3hrs內(nèi)TNF-α濃度下降，差異有顯著性(p＜0.05)；3hrs以后差異不顯著(p＞0.05)。 血漿中IL-6含量在建模1hr即增高達到頂峰，3hrs以后的模型組IL-6水平與對照組相比有顯著差異(p＜0.01,p＜0.05)。scFv干預后IL-6的含量下降比較明顯，但除干預后6hrs組和同一時相點的模型組相比有顯著差異外(p＜0.01)，其余各組差異均無顯著

11、性(p＞0.05)。 結(jié)論：一、運用桿狀病毒表達系統(tǒng)表達、純化獲得了NH-LBP；成功地從人外周血淋巴細胞中構(gòu)建了人源化的單鏈抗體庫。運用核糖體展示技術對單鏈抗體庫進行體外翻譯、篩選，獲得了可與NH-LBP高度結(jié)合的編碼scFv抗體的cDNA，經(jīng)過序列分析比對符合scFv的序列特征。 二、應用嗜甲醇畢赤酵母表達系統(tǒng)和金屬螯合層析等方法表達純化出重組的抗NH-LBP的scFv抗體，相對分子質(zhì)量約為35kDa。經(jīng)過體內(nèi)外生物

12、學活性實驗顯示：在細胞水平，人源化的抗NH-LBPscFv抗體能夠在一定程度上阻斷FITC-LPS與U937細胞的結(jié)合。在體實驗結(jié)果表明燒傷合并內(nèi)毒素血癥小鼠經(jīng)scFv抗體干預后血漿中炎性細胞因子TNF-α和IL-6的含量有所下降，部分內(nèi)臟器官的炎性改變減輕，提示該抗體對內(nèi)毒素血癥動物有一定的保護作用。 三、本研究率先運用人源化基因工程抗體技術來研究內(nèi)毒素血癥的防治，首次在酵母細胞中表達獲得抗NH-LBP的scFv抗體。該研究結(jié)