乙肝病毒核心蛋白基因工程改造及其生物學(xué)功能鑒定.pdf

1、目的:探討基于乙肝病毒核心蛋白(HBc)的改造位點(diǎn)及形式，使形成攜帶細(xì)胞穿膜肽或配體的核心顆粒，以作為HBV感染模型改造的基礎(chǔ)。
　　方法:
　　1.用不依賴酶切連接的分子克隆方法(RLIC)構(gòu)建HBc、HBV1.1c-及各種HBc改造質(zhì)粒。
　　2.將各種HBc重組體與HBV1.1c-共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，通過(guò)提取細(xì)胞內(nèi)核心顆粒DNA，Southern blot檢測(cè)DNA中間體，來(lái)判斷相應(yīng)基因工程改造HBc是否支持

2、HBV復(fù)制，形成包裹核酸的核心顆粒。
　　結(jié)果:
　　1.成功構(gòu)建在HEK293細(xì)胞內(nèi)有效支持HBV復(fù)制的WtHBc與HBV1.1c-反式互補(bǔ)系統(tǒng);
　　2.HBc釘突部位aa79-80缺失或替換不支持HBV復(fù)制;
　　3.HBc aa86-93缺失或替換后功能缺陷;
　　4.HBc N末端插入短肽后能以較低水平支持HBV復(fù)制;
　　5.HBc N末端可作為普遍有效的融合位點(diǎn)，用A/B/C接頭連接，可

3、支持長(zhǎng)片段EGFP(238aa) RFP(225aa)、VSVG(511aa)融合。
　　結(jié)論:我們構(gòu)建了有效的HBc與HBV1.1c-反式互補(bǔ)系統(tǒng)，該系統(tǒng)可檢測(cè)各種改造的HBc是否具有包裹核酸形成核心顆粒類病毒(VLPs)的功能。利用該系統(tǒng)，我們檢測(cè)到HBc aa79-80及aa86-93缺失或替換后均存在功能缺陷，這些序列可能與HBc的完整結(jié)構(gòu)及功能有關(guān)。N末端可作為有效的改造位點(diǎn)，支持各種長(zhǎng)度的外源蛋白融合，可長(zhǎng)達(dá)511aa