柑橘潰瘍病菌hfq基因克隆與功能研究.pdf

1、柑橘潰瘍病菌（Xanthomonas citri subsp. citri, Xcc）引起的柑橘潰瘍病是世界性的檢疫病害，嚴重危害柑橘果實的品質(zhì)，對世界柑橘產(chǎn)業(yè)構(gòu)成巨大威脅。目前柑橘潰瘍病的防控主要依賴化學(xué)防治，長期過度使用農(nóng)藥，不僅病原菌產(chǎn)生耐藥性，而且影響果品安全、惡化生態(tài)環(huán)境。因此開展病原菌相關(guān)功能基因研究，解析病原菌致病機理，將為綠色防控技術(shù)研發(fā)奠定基礎(chǔ)。隨著2002年首個柑橘潰瘍病菌全基因組序列的公布，有力促進病原菌中功能基因

2、的相關(guān)研究。hfq基因編碼的Hfq蛋白（Host Factor for RNA Phage Qβ）廣泛存下于革蘭氏陰性和陽性細菌中，作為分子伴侶與sRNA（Small Non-coding RNA）結(jié)合，參與基因的表達調(diào)控。已有研究表明，hfq有調(diào)節(jié)病原菌毒性、游動性、生長力、胞外酶形成等生物學(xué)功能，柑橘潰瘍病菌hfq基因全長279bp，編碼93個氨基酸。為了探究hfq基因在柑橘潰瘍病菌中的作用，本研究構(gòu)建2個致病力差異菌株（Xcc29

3、-1和Xcc49）hfq基因的缺失突變體（29-1Δhfq和49Δhfq）與回補菌株（29-1Δhfq-C和49Δhfq-C）并進行生物學(xué)特性實驗。初步明確hfq基因在柑橘潰瘍病菌的生長代謝、生物膜形成、胞外酶及胞外多糖的形成、細菌的游動性、致病性等方面的影響。同時通過原核鏈轉(zhuǎn)錄組測序分析，進一步明確hfq基因在柑橘潰瘍病菌中的功能。主要研究結(jié)果如下：
　　1、分別擴增hfq基因上下游側(cè)翼序列，連接到自殺載體pK18mobSacB

4、，將獲得的重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)入潰瘍病菌的感受態(tài)細胞，優(yōu)化同源重組篩選體系最終獲得2個菌株的hfq基因缺失突變株。擴增含有啟動子的hfq基因，連接到pBBR1MCS-5表達載體上，電轉(zhuǎn)hfq突變株獲得回補菌株。
　　2、將野生型菌株、突變株、回補菌株三者同時進行生物學(xué)實驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，hfq基因的缺失突變株與野生型和回補菌株相比生長緩慢、游動性顯著降低、胞外蛋白酶和胞外淀粉酶的產(chǎn)生也較低、生物膜的形成明顯減少；同時對 H2O2和 pH脅迫較

5、敏感；但突變株的胞外多糖、致病力等與野生型菌株和回補菌株無顯著差異。生物學(xué)特性實驗表明，hfq基因?qū)Ω涕贊儾【纳L、胞外酶的產(chǎn)生、細菌游動性、脅迫應(yīng)答有重要作用，對致病力則無顯著影響。
　　3、為進一步明確hfq基因在柑橘潰瘍病菌中的作用，對野生型菌株（Xcc29-1和Xcc49）以及突變株（29-1Δhfq和49Δhfq）進行原核鏈特異性轉(zhuǎn)錄組測序分析。結(jié)果顯示29-1Δhfq相對于Xcc29-1有746個差異表達基因，其中

6、662個基因下調(diào)表達，84個基因上調(diào)表達；49Δhfq相對于Xcc49有257個差異表達基因，其中172個基因下調(diào)，85個基因上調(diào)。突變體相對于野生型菌株下調(diào)的基因主要富集在趨化行為、群體感應(yīng)、鞭毛組分、雙組份系統(tǒng)以及分泌系統(tǒng)，上調(diào)基因主要分布在核糖體合成和分泌系統(tǒng)等途徑。鞭毛組分和趨化性相關(guān)基因下調(diào)表達，結(jié)合hfq突變株在半固體培養(yǎng)基上游動性較弱，說明hfq基因參與調(diào)節(jié)柑橘潰瘍病菌的運動相關(guān)基因的表達；群體感應(yīng)中缺失hfq引起部分基因

7、下調(diào)表達，表明該基因參與調(diào)控柑橘潰瘍病菌群體感應(yīng)；雙組份系統(tǒng)在響應(yīng)外界環(huán)境變化中有重要作用，其基因下調(diào)表達，結(jié)合突變體比野生型菌株對H2O2和pH更敏感，推測hfq基因可能在柑橘潰瘍病菌的脅迫應(yīng)答中發(fā)揮作用；核糖體是蛋白合成的場所，缺失hfq會引起大量核糖體相關(guān)基因上調(diào)表達，說明hfq可能參與調(diào)節(jié)柑橘潰瘍病菌部分基因的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。
　　4、轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)顯示，野生型菌株Xcc29-1和Xcc49菌株在細菌II型和IV型分泌系統(tǒng)中存在大