三個(gè)病原物誘導(dǎo)啟動(dòng)子在轉(zhuǎn)基因柑橘中受潰瘍病菌和創(chuàng)傷誘導(dǎo)的表達(dá)分析.pdf

1、在植物抗病基因工程育種中，利用CaMV35S等組成型啟動(dòng)子調(diào)控抗性基因(如抗菌肽、病程相關(guān)蛋白、R-gene)的表達(dá)是一種常見的表達(dá)策略。但功能基因組成型表達(dá)往往會(huì)產(chǎn)生大量異源蛋白質(zhì)或?qū)е麓x產(chǎn)物在植物體內(nèi)積累，打破植物原本的代謝平衡，不利于產(chǎn)量和品質(zhì)的提高;有些代謝產(chǎn)物對植物并非必需甚至有毒害作用，阻礙了植物的正常生長，甚至導(dǎo)致死亡。選用合適的病原誘導(dǎo)啟動(dòng)子控制抗病相關(guān)基因的表達(dá)，能夠定時(shí)的啟動(dòng)抗性基因的表達(dá);避免外源基因在植物體內(nèi)的

2、過量表達(dá)，進(jìn)而降低甚至消除對植株生長發(fā)育的負(fù)面影響。在柑橘潰瘍病抗病基因工程研究中，很少有關(guān)于利用病原物誘導(dǎo)啟動(dòng)子控制抗性基因提高柑橘抗性的研究報(bào)道，更沒有關(guān)于柑橘來源的病原物誘導(dǎo)啟動(dòng)子的研究文獻(xiàn)。因此，如何利用其它物種來源的病原物誘導(dǎo)啟動(dòng)子調(diào)控抗病基因，提高柑橘對潰瘍病的抗性值得研究。
　　 本文分析了來源于煙草和馬鈴薯的病原物誘導(dǎo)啟動(dòng)子在柑橘中的表達(dá)特征，主要結(jié)果如下:
　　 1，病原誘導(dǎo)啟動(dòng)子的克隆
　　

3、ppp1和hrs203j是來源于煙草的病原誘導(dǎo)啟動(dòng)子，能響應(yīng)多種病原菌;gst1是來源于馬鈴薯的病原誘導(dǎo)啟動(dòng)子，對病原菌具有廣譜的響應(yīng)。根據(jù)ppp1、gst1、hrs203j啟動(dòng)子的堿基序列，設(shè)計(jì)引物。PCR擴(kuò)增相應(yīng)的啟動(dòng)子，通過T-克隆測序驗(yàn)證，獲得了正確的啟動(dòng)子序列。
　　 2，病原誘導(dǎo)啟動(dòng)子與gus報(bào)告基因融合的植物表達(dá)載體的構(gòu)建
　　 用HindⅢ和BamHI將測序正確的啟動(dòng)子從T-載體上酶切下來，連接到同樣用H

4、indⅢ和BamHI處理的pBI121載體上，構(gòu)建與gus報(bào)告基因融合的植物表達(dá)載體:PBI121-ppp1、PBI121-gst1、PBI121-hrs203j;
　　 3，三個(gè)啟動(dòng)子的傷誘導(dǎo)表達(dá)特征分析
　　 1)GUS組織化學(xué)染色結(jié)果表明，傷誘導(dǎo)處理前，在ppp1和hrs203j轉(zhuǎn)基因柑橘中，未檢測到gus基因表達(dá)，而在gst1轉(zhuǎn)基因柑橘中，檢測到gus基因的本底表達(dá);ppp1啟動(dòng)子轉(zhuǎn)基因柑橘葉圓片在傷誘導(dǎo)處理24

5、h時(shí)染色最深，gst1啟動(dòng)子轉(zhuǎn)基因柑橘葉圓片在傷誘導(dǎo)處理12h時(shí)染色最深，hrs203j幾乎在柑橘中不具有表達(dá)功能。
　　 2)Real-timePCR和GUS酶活分析表明，ppp1在傷誘導(dǎo)處理之前激活gus基因表達(dá)量很低，傷誘導(dǎo)處理24h，gus基因表達(dá)量和GUS酶活顯著提高;gst1在傷誘導(dǎo)處理前存在背景活性，傷誘導(dǎo)處理12h，gus基因表達(dá)量和GUS酶活明顯提高。
　　 4，三個(gè)啟動(dòng)子潰瘍病細(xì)菌誘導(dǎo)分析
　　

6、 1)GUS組織化學(xué)染色結(jié)果表明，在未接種病原物時(shí)，在ppp1和hrs203j轉(zhuǎn)基因柑橘中，未檢測到GUS表達(dá)，而在gst1轉(zhuǎn)基因柑橘中，檢測到gus基因的本底表達(dá);處理5d時(shí)，在ppp1轉(zhuǎn)基因葉片中出現(xiàn)藍(lán)色斑點(diǎn);10d后，葉片出現(xiàn)病斑，此時(shí)藍(lán)色斑點(diǎn)主要集中病斑處，且ppp1和gst1都達(dá)到最高表達(dá)水平。
　　 2)Real-timePCR和GUS酶活定量分析表明，潰瘍病處理之前(0d)，ppp1激活gus基因的表達(dá)水平極低，