硫酸銅誘導(dǎo)對(duì)柑橘潰瘍病菌抗銅性及抗銅相關(guān)基因表達(dá)的影響.pdf

1、柑橘潰瘍病(Citrusbacterialcankerdisease，CBCD)是由地毯草黃單胞桿菌柑橘致病變種(Xanthomonasaxonopodispv.citri(Hasse)Vauterin)引起的一種細(xì)菌性病害。在自然條件下，該病菌可以侵染蕓香科多種植物，造成柑橘的樹勢(shì)衰退和果實(shí)形成潰瘍斑，從而降低柑橘果品產(chǎn)量及質(zhì)量，對(duì)我國柑橘出口和產(chǎn)業(yè)發(fā)展造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。目前果園中大多使用硫酸銅、氫氧化銅和氯化銅等化學(xué)藥劑進(jìn)行防治。

2、為明確含銅殺菌劑的長期使用對(duì)該病菌抗藥性產(chǎn)生的影響，本研究對(duì)柑橘潰瘍病菌抗銅相關(guān)基因copA和copB進(jìn)行了克隆和原核表達(dá)載體的構(gòu)建；測(cè)定了在室內(nèi)硫酸銅選擇壓力下柑橘潰瘍病菌抗銅性的變化，具體研究結(jié)果如下：
　　 1.以提取的柑橘潰瘍病菌DNA為模板，對(duì)抗銅相關(guān)基因copA和copB進(jìn)行了PCR擴(kuò)增，獲得了大小分別為1798bp和1111bp的目標(biāo)片段，并對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行了克??；構(gòu)建了這兩個(gè)基因的原核表達(dá)載體(pET-copA和p

3、ET-copB)，并在大腸桿菌(Escherichiacoli)BL21(DE3)中經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE電泳，結(jié)果顯示，約69kDa和46kDa的copA和copB特異性重組蛋白得到有效表達(dá)。利用原核表達(dá)的融合蛋白免疫大耳白兔，制備了copA和copB的多克隆抗體。用間接ELISA法測(cè)定了所制備的copA和copB多克隆抗體的效價(jià)均為1：6400，確定了該抗體的工作濃度范圍為1:2000-1:5000。同時(shí)利用

4、制備的抗體對(duì)原核表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行了westernblot分析，結(jié)果顯示制備的抗體可與原核表達(dá)蛋白發(fā)生特異性反應(yīng)，并且純化后的抗體非特異性條帶較少。
　　 2.分析了抗銅相關(guān)基因copA和copB的誘導(dǎo)表達(dá)對(duì)大腸桿菌BL21(DE3)的抗銅性影響，結(jié)果顯示，將構(gòu)建的原核表達(dá)載體(pET-copA和pET-copB)轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)并誘導(dǎo)表達(dá)，對(duì)大腸桿菌的增殖有明顯的抑制作用，但在含不同濃度硫酸銅的培養(yǎng)基中的增殖無明顯差異

5、，表明copA和copB基因的過量表達(dá)可使大腸桿菌抗銅性維持在一定的水平。
　　 3.以4個(gè)柑橘潰瘍病菌菌株為出發(fā)菌株，其硫酸銅半數(shù)致死濃度為100μg/ml，通過在硫酸銅濃度逐步提高的培養(yǎng)基中繼代培養(yǎng)近1年，這些菌株對(duì)CuSO4濃度抗性明顯提高，其致死濃度由原來的150μg/ml提高到270μg/ml-280μg/ml；利用制備的copA和copB的多克隆抗體，對(duì)9號(hào)菌株的出發(fā)菌株和耐銅菌株中copA和copB基因的表達(dá)進(jìn)行w