選擇性捕獲雞白痢沙門菌在巨噬細胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄序列.pdf

1、雞白痢沙門菌呈世界范圍分布。目前，在西方部分發(fā)達國家雞白痢已經(jīng)被消滅或基本消滅，而在國內(nèi)該病的危害仍嚴重。雞白痢沙門菌多造成2-3周齡雛雞死亡，成年雞則可帶菌而無臨床癥狀。感染后存活的雞常表現(xiàn)生殖系統(tǒng)病變，引起蛋雞產(chǎn)蛋量下降，并污染種蛋，造成巨大的經(jīng)濟損失。該病既可垂直傳播，又可水平傳播，造成嚴重的危害。探究雞白痢沙門菌潛在的致病基因，了解其致病機理，對于尋求新的有效防治措施具有重要的意義。
　　 隨著各種分子生物學(xué)和免疫學(xué)研究

2、手段的出現(xiàn)，人們對病原體在感染宿主過程中轉(zhuǎn)錄基因序列的研究也逐漸深入。選擇性捕獲轉(zhuǎn)錄序列(selective capture oftranscribed sequences，SCOTS)技術(shù)在研究病原體體內(nèi)轉(zhuǎn)錄序列方面有著獨特的優(yōu)勢。本研究比較了雞白痢沙門菌在雞體內(nèi)和體外巨噬細胞系中的存活消亡趨勢，以雞巨噬細胞系HD-11為侵染模型，用SCOTS技術(shù)捕獲該菌在巨噬細胞中的轉(zhuǎn)錄序列，并初步分析了其中一個序列在侵染細胞過程中的轉(zhuǎn)錄水平。

3、r>　　 ⑴雞白痢沙門菌體內(nèi)外侵染實驗。為了探究雞白痢沙門菌S06004在與雞體單核吞噬細胞系統(tǒng)和體外巨噬細胞系的相互作用的過程中，細菌定殖、復(fù)制的變化趨勢，進行了細菌的體內(nèi)侵染實驗和體外巨噬細胞侵染實驗。體內(nèi)侵染實驗中，以口服和肌注兩種方式感染9日齡非免疫海藍蛋雞，感染后第三天吞噬細胞中的細菌量都達到最高點，第九天下降到每克組織中帶菌量不足500 cfu，且這種狀態(tài)能夠持續(xù)至少5天。在體內(nèi)侵染實驗中，細菌的定殖趨勢為先發(fā)生復(fù)制增殖、

4、后消減至很低水平，并且低水平的帶菌狀態(tài)會維持一段時間。同時在體外侵染實驗中，不論給予細菌1h還是2.5h的作用時間，進入巨噬細胞內(nèi)的細菌量在增殖3h左右時都達到最高點，消減到較低的水平后，能夠維持一段時間。在體外實驗中胞內(nèi)的細菌同樣具有先增殖后消減，并維持一段低水平細菌攜帶率的平臺期的存活趨勢。雞白痢沙門菌S06004株對雞巨噬細胞系HD-11的體外侵染實驗結(jié)果和體內(nèi)吞噬細胞侵染實驗結(jié)果基本吻合，故采用雞白痢沙門菌侵染雞巨噬細胞系HD-

5、11可以在一定程度上模擬細菌體內(nèi)感染時與內(nèi)臟器官吞噬細胞系統(tǒng)的相互作用。
　　 ⑵選擇性捕獲雞白痢沙門菌在巨噬細胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄序列。應(yīng)用SCOTS方法鑒定雞白痢沙門菌S06004株在感染雞巨噬細胞系HD-11過程中細菌表達的基因。根據(jù)細菌體內(nèi)和體外侵染實驗的研究結(jié)果，選用雞白痢沙門菌S06004侵染雞巨噬細胞系HD-11，以模擬細菌體內(nèi)侵染吞噬細胞過程，通過SCOTS技術(shù)對轉(zhuǎn)錄序列cDNAs的選擇性捕獲，檢測了細菌在與巨噬細胞相互作

6、用過程中毒力基因以及相關(guān)調(diào)控基因的表達，共得到16個序列。除了一個未知序列，這些體內(nèi)轉(zhuǎn)錄序列包括毒力相關(guān)的Ⅲ型分泌系統(tǒng)中分泌素蛋白和Ⅰ型分泌系統(tǒng)中外膜蛋白的編碼基因、代謝相關(guān)的敏感激酶和核苷水解酶的編碼基因、運輸功能基因、一些質(zhì)粒編碼基因以及環(huán)境適應(yīng)性功能基因等。
　　 ⑶實時熒光定量PCR動態(tài)分析雞白痢沙門菌體內(nèi)轉(zhuǎn)錄序列7-6在侵染過程中的轉(zhuǎn)錄水平。根據(jù)SCOTS技術(shù)捕獲得到的體內(nèi)轉(zhuǎn)錄序列7-6，設(shè)計了針對其特異性檢測的一對引